[发明专利]一种OCH1缺陷型抗CD20四价抗体表达毕赤酵母的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种OCH1基因缺陷型抗CD20 四价抗体表达毕赤酵母菌株的构建方法。

背景技术

毕赤酵母表达系统，是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一，与现有的其 它表达系统相比，巴斯德毕赤酵母在表达产物的加工、外分秘、翻译后修饰以及 糖基化修饰等方面有明显的优势，现已广泛用于外源蛋白的表达。但是，毕赤酵 母不适于糖蛋白的表达，其表达产物为高甘露糖型，容易在人体中产生免疫反应， 限制了毕赤酵母作为宿主菌的使用。OCH1基因编码的α-1,6-甘露糖转移酶的存 在，是导致高甘露糖形成的重要原因。对OCH1基因的敲除，可有效阻断酵母 对糖蛋白的翻译后高甘露糖化修饰，得到的糖蛋白为低甘露糖结构，可规避毕赤 酵母高甘露糖修饰弊端，同时为毕赤酵母后续糖基化改造作基础。

CD20抗原是一种B细胞分化抗原。由于CD20仅在前-B淋巴细胞、未成 熟B淋巴细胞、成熟B淋巴细胞、激活B淋巴细胞中表达,而在浆细胞、淋巴 多能干细胞以及其它组织均无CD20的表达,在人体血清中亦无游离CD20的存 在。因此CD20可作为B淋巴细胞瘤治疗的一个很好治疗靶点。专利 CN101544694A中公布了一种抗CD20四价抗体的制备方法，但由于其使用的表 达载体是大肠杆菌，可能含有内毒素而影响其作为医药蛋白的应用。

毕赤酵母作为真核细胞具有与人体细胞相似的N-糖基化代谢途径，但是毕 赤酵母和人的N-糖基化过程还存在一定差异。毕赤酵母的N-糖基化修饰为高甘 露糖型N-糖基化(Heavymannosetype)，而人体细胞中的N-糖基化修饰主要为复 杂型N-糖基化(Complextype)和杂合型N-糖基化(Hybridtype)。毕赤酵母中产生 的高甘露糖型的N-糖基化修饰，一方面会改变药用糖蛋白的活性和反应动力学 特征，另一方面进入人体后可能导致过敏反应。因此，未经改造的毕赤酵母，并 不适合于大部分医药用糖蛋白的生产。

目前绝大半部分医药类蛋白都是利用哺乳动物细胞生产的。然而，因为哺乳 动物表达体系本身还存在生产成本过高、产量偏低、培养过程中容易受到污染等 问题，限制了其在医药蛋白领域的大规模应用。为了解决这一问题，研究人员较 早的就开始寻求在大肠杆菌和芽孢杆菌等原核微生物中表达这些蛋白。但原核生 物由于缺乏对真核生物蛋白质的复性功能、缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系 统、内源性蛋白酶降解空间构象不正确的外源蛋白、细胞周质内含有种类繁多的 内毒素等特点为医药蛋白的生产带来了诸多不便。采用同属真核细胞并拥有较强 分泌蛋白能力的毕赤酵母作为医药蛋白表达体系，是解决当前蛋白难以实现低成 本、批量化生产的最佳选择。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种OCH1基因缺陷型 抗CD20四价抗体表达毕赤酵母菌株的构建方法：包括以下步骤：

一、重组菌Δoch1OCH1菌株的构建

1)、构建融合成基因och1

以毕赤酵母X-33基因组为模板，克隆OCH1基因的上游和下游两段同源序 列，将OCH1基因的上游和下游两段同源序列融合成基因och1，所述融合基因 中缺失OCH1基因的开放阅读框；

2)、克隆乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因URA3；

3)、将1)中所得融合基因och1和2)中所得URA3导入毕赤酵母载体 pPICZαA，构建得到pPICZαA-URA3-och1质粒；

4)、将pPICZαA-URA3-och1质粒转化毕赤酵母菌株JC308，经基因组筛选 和表型筛选，得到阳性克隆Δoch1-菌株；

二、抗CD20四价抗体表达菌株的构建

1)、构建C₂B₈单链抗体ScFv基因与人抗体IgG₁Fc的融合基因 C₂B₈(ScFvHL)₂Fc