[发明专利]一种抑制肿瘤细胞增殖的重组腺病毒载体的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及含肽的医药配制品，具体涉及含人端粒酶逆转录酶(hTERT)C端的重组载体的构建方法，该方法所得到的重组载体可抑制肿瘤细胞增殖。

背景技术

人DNA末端是非编码的TTAGGG重复序列，即端粒。由于末端复制问题，正常体细胞每分裂一次，端粒缩短50-200bp，当端粒缩短到一定程度不能维持DNA的稳定时，细胞即开始凋亡或程序性死亡。肿瘤细胞与正常细胞的最大区别之一是90％以上的肿瘤细胞表达端粒酶活性，可以延长端粒，使肿瘤细胞得以永生。因此，端粒酶成为识别肿瘤细胞和正常细胞的重要标志之一，成为抗肿瘤作用的重要靶点。

传统的通过抑制端粒酶活性抗肿瘤作用的抑制剂，如针对端粒酶模板区(hTR)或逆转录酶(hTERT)的反义寡核苷酸(antisense oligodeoxyribonucleotides,ASODN)都是抑制端粒酶活性，使端粒缩短而发挥抗肿瘤作用。但即使是肿瘤细胞其端粒也足够长(2～10kb)，体外培养的细胞倍增时间一般>10h，即使没有端粒酶，每天端粒缩短也只有0.1～0.2kb(Harley CB et al.Nature.1990.345(6274):458-460)。所以，端粒酶完全被抑制使端粒缩短到临界点时一般也需要7～30天甚至更长才能发挥作用，尤其是体内给药时(肿瘤细胞体内的倍增时间>30天)。在这个漫长的过程中，许多细胞的端粒依然得以维持或代偿，使得效果难以理想，往往都需要与化疗或放疗合用。近年来发现，端粒酶除了通过延长端粒促进肿瘤生长外，还有端粒外作用，如直接与NF-κB靶基因启动子DNA结合并与P65亚基作用启动有关的癌基因表达(Martínez Pet al.Nat Rev Cancer.2011.11(3):161-176；Ghosh A et al.Nat Cell Biol.2012.14(12):1270-1281)等，这些端粒外功能同样可以促进肿瘤的生长。目前的端粒酶抑制剂都是针对缩短端粒设计的，对端粒外功能没有影响，这也是端粒酶抑制剂效果不理想的重要原因之一。这类药物中研究较多、也是唯一进入临床试验的药物是GRN163L(又叫Imetelstat)，但起效慢，效果也难以令人满意(Crees Z et al.Curr Pharm Des.2014；20(41):6422-37)。

另一类进入临床试验的针对端粒酶逆转录酶的抗肿瘤药物是hTERT抗原肽。肿瘤细胞可以将hTERT的部分肽段呈递在细胞膜上作为肿瘤细胞的特异性抗原，将这些特异性抗原呈递给树突状细胞(DCs)可诱发细胞毒性T细胞杀伤肿瘤细胞作用。体外合成这些短肽或用病毒载体表达这些短肽作为抗原，可特异性杀伤端粒酶阳性的肿瘤细胞，如Vx-001疫苗(Kotsakis A et al.Ann Oncol.2012,23(2):442-9)。hTERT抗原肽用于肿瘤的免疫治疗，免疫原性较低，治疗窗较窄，只适用于表达相应的hTERT抗原肽的肿瘤细胞，临床使用首先要筛选肿瘤抗原类型，分离自身树突状细胞并反复致敏后回输体内。操作复杂，疗效较低。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是提供一种抑制肿瘤细胞增殖的重组腺病毒载体的构建方法，该方法所得到重组腺病毒载体不仅可抑制肿瘤细胞增殖，而且起效快。

本发明解决上述技术问题的方案如下：

一种抑制肿瘤细胞增殖的重组腺病毒载体的构建方法，该方法由以下步骤组成：

(1)取如SEQ ID NO.1所示的N端带有6个his标签的人端粒酶C端第936-1132片段(命名为C197)的编码序列，经双酶切、连接反应克隆至含有绿色荧光蛋白基因GFP的穿梭质粒中，得到重组穿梭质粒(命名为PAdTrack-GFP-C197)；

(2)将得到的重组穿梭质粒进行PmeⅠ酶切线性化，通过与骨架质粒PAdEasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组，得到重组腺病毒质粒；

(3)将得到的重组腺病毒质粒转染HEK293细胞进行重组包装，收集具有绿色荧光的细胞，得到细胞包装的重组腺病毒；

(4)将得到细胞包装的重组腺病毒采用氯化铯梯度离心法进行纯化，得到重组腺病毒载体(命名为Ad-GFP-C197)。

上述方法中，所述SEQ ID NO.1所示基因片段由上海生物公司根据本发明人所提供的序列合成。