[发明专利]基于甲基化水平检测脆性X染色体综合征的定量比较法及其引物

说明书

技术领域

本发明涉及先天性遗传缺陷脆性X染色体综合症(Fragile X syndrome,FXS)检测，属于分子生物学及遗传病临床诊断领域，对脆性X染色体综合征FMR1基因的5’端上游CpG岛异常甲基化水平的定量检测。

背景技术

脆性X染色体是指X染色体的Xq27-q28区出现细丝状次缢痕，末端呈随体结构，因而该部位易发生断裂，故称脆性位点。这种非正常状态的X染色体导致的疾病称脆性X染色体综合征，是仅次于先天愚型的第二大遗传性智力低下综合征，遗传方式为X连锁遗传。主要临床表现为语言发育迟缓，智力障碍(IQ30-50)，面部异常：长脸，大耳，下颌大而前突，并伴随攻击性行为和孤独症。该病多见于男性(群体发病率约0.025％)，由于女性有两条X染色体，所以通常表现为轻度智力低下，发病率约为男性一半。

脆性X染色体综合征致病基因FMR1(Fragile X Mental Retardation)位于Xq27.3，该基因5’非编码区(CGG)n三核苷酸重复序列在正常人群中重复数目6～54次。当重复数目增加至55～200次时，称前突变，前突变不会引起相邻CpG岛甲基化，通常无或只伴随轻微症状。当重复数目达到200次以上，称为全突变，将导致相邻CpG岛异常甲基化，进而导致FMR1基因的表达下调甚至沉默引起疾病。通常，女性前突变携带者的CGG重复序列在遗传给后代的过程中极易发生突增，造成后代全突变。

脆性X染色体综合征患者FMR1基因的启动子区CpG岛发生异常甲基化，在转录水平被沉默，因此导致基因表达产物FMRP(Fragile X Mental Retardation Protein)的缺失。FMR1基因含有17个外显子，通过可变剪接机制可产生12种不同蛋白亚型。在不同组织器官具有不同水平的表达。FMRP是一种重要的RNA结合蛋白，可以结合若干编码，非编码RNA或microRNA。FMRP是一种重要的RNA结合蛋白，与RNA的转运、稳定性以及翻译有重要联系。在神经元中，FMPR的缺失将导致突触可塑性过度增加，影响长期记忆等，导致脆性X染色体综合征。

脆性X染色体综合征的诊断技术自上世纪八十年代逐步发展，Rousseau等1991年报道了Southern Blot技术，可检出CGG重复序列的异常扩展，也可评估甲基化异常状态。但是该方法实验操作繁锁、实验周期长、对DNA纯度要求苛刻、只能平行检测少量样本，且成本费 用很高，因此难以进行大规模筛查诊断，临床应用十分有限。聚合酶链式反应(PCR)技术操作简便，可以检出CGG重复数目较少的前突变，但随着重复数目增多，该方法的灵敏度逐渐下降，信号易缺失，无法判断结果，故难以准确检出大于200次的CGG全突变，虽然近年来传统方法得到一定程度的改善，如嵌合引物(chimera primer)和毛细管电泳技术的使用，但对CGG高重复数的检测仍尚未达到稳定可靠的程度。因此，美国疾病控制与预防中心指出，甲基化异常的检测对脆性X染色体综合征的诊断十分必要，其指示作用甚至高于通过CGG重复数目做出的判断。

甲基化检测技术近年来发展迅速，如甲基化特异性PCR(MS-PCR)，甲基化荧光定量PCR(MethyLight)，甲基化特异性高分辨率溶解曲线(MS-HRM)，亚硫酸氢盐修饰焦磷酸测序(BS-Pyrosequencing)等技术被广泛应用于癌症及遗传病分子诊断中。焦磷酸测序技术可实现同时准确测序及精确定量，通过边合成边测序的原理一次加入一种碱基，保证测序结果的准确性；通过递进式生物发光反应(发光计量线性相关系数R²>0.99)实现精确定量。焦磷酸测序重复性好、结果稳定、速度快(通常一个完整的反应仅需30分钟至1小时)、应用灵活、易于操作、输出量高，可同时检测96个样品。在甲基化检测的应用方面焦磷酸测序技术也有独特的优势，相较于普通MS-PCR具有更好的灵活性，不但可应用于CpG富集区，而且可应用于CpG寡聚区，拓宽了其可应用区域；焦磷酸测序通过连续多对测序引物可以实现广覆盖的甲基化定量检测且降低检测成本，这是大多数其他甲基化检测技术无法实现的。脆性X染色体综合征具有独特的遗传方式，前突变只通过女性向后代扩展为全突变。焦磷酸测序具备对单一等位片段检测的能力，这可能提供非常有价值的遗传信息。