[发明专利]来自LT亚基的细胞穿膜肽LTA2作为细胞内药物运输载体的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地讲，涉及一种来自LT亚基的细胞穿膜肽LTA₂作为跨膜载体的应用。

背景技术

细胞膜是细胞与周围环境进行物质交换和信息传递的重要通道，它以磷脂质双层作为基本骨架，在骨架上镶嵌有各种类型的膜蛋白以及与膜蛋白结合的糖和脂质。细胞膜的特殊结构使其具有了膜内部疏水、膜两侧亲水的特性，再加上膜内具有特殊作用的孔隙和跨膜蛋白，使其能够调控细胞内外物质的运输。由于其对物质特殊的选择透过性，对细胞形成保护的同时，也将许多潜在的生物大分子药物阻挡在细胞之外。

许多生物大分子，如多肽、蛋白质、核酸不能进入细胞，难以在目标器官和组织的细胞中发挥作用，从而限制了他们在体内的应用。虽然通过物理方式，诸如：电穿孔法、显微注射法、穿孔素蛋白法等，能够将生物大分子导入到细胞内。但是，导入效率低、对细胞刺激大、靶向性不强，操作复杂等缺点，极大地限制了这类方法的应用。因此，很多研究者致力于寻求更为有效的穿膜方式。

近年来，研究者发现了一类具有特殊功能的短肽，如TAT、PEP-1、MAP、MPG、Penetratin、Stearyl-R8、MPGΔNLS，这类短肽不但能够直接穿过细胞膜进入细胞，而且能够介导外源蛋白、核酸、脂质体等大分子进入细胞。这些具有细胞穿透功能的短肽被命名为细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs)。

穿膜肽的穿膜机制至今还不完全清楚，不同的细胞穿膜肽跨膜机制不同，目前被广泛认可的方式包括以下三种：1、反相胶粒模型(inverted micelle model)，穿膜肽通过细胞膜上磷脂分子的移动形成反相胶粒结构，进而进入胞浆；2、孔隙结构模型(pore formation model)，穿膜肽在细胞膜上形成跨膜的孔隙结构而进入胞浆；3、内吞方式进行细胞摄取。

细胞穿膜肽可以通过化学交联或基因融合表达等方式携带各种大分子。CPPs携带的物质可以为蛋白质(荧光蛋白、核酸酶等)、多肽(100个氨基酸残基以下)、核酸、化学小分子药物、纳米颗粒、噬菌体颗粒、荧光素、脂质体、超顺磁性粒子等。最大可以运载分子量120kDa、直径40mm的大分子物质，且目前没有明确的证据表明穿膜肽具有运载极限。穿膜肽的转导作用具有许多独特之处。穿膜肽对生物大分子的转运效率高，进入细胞速度快，对细胞毒性低，生理状态下稳定、无免疫性。这种多肽介导的生物活性分子透膜技术，在许多方面优于物理的透膜方式，而且肽链可以进行多种修饰，这类短肽在未来的细胞给药中将会发挥重要作用。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供LTA₂肽段作为细胞内药物运输载体的应用。

本发明的第二个目的在于提供LTA₂肽段在制备细胞内药物运输载体中的应用。

本发明的第三个目的在于提供一种融合蛋白药物的制备方法。

为实现本发明第一个目的，本发明公开以下技术方案：LTA₂肽段作为细胞内药物运输载体的应用，所述LTA₂的序列如SEQ ID NO：1所示。即：

DTCNEETQNLSTIYLREYQSKVKRQIFSDYQSEVDIYNRIRDEL(SEQ ID NO：1)(天冬氨酸一苏氨酸一半光氨酸一天冬酰氨一谷氨酸一谷氨酸一苏氨酸一谷氨酰胺一天冬酰氨一亮氨酸一丝氨酸一苏氨酸一异亮氨酸一酪氨酸一精氨酸一谷氨酸—酪氨酸—谷氨酰胺—丝氨酸—赖氨酸—缬氨酸—赖氨酸—精氨酸—谷氨酰胺—异亮氨酸—苯丙氨酸—丝氨酸—天冬氨酸—酪氨酸—谷氨酰胺—丝氨酸—谷氨酸—缬氨酸—天冬氨酸—异亮氨酸—酪氨酸—天冬酰氨—精氨酸—异亮氨酸—精氨酸—天冬氨酸—谷氨酸—亮氨酸)。本发明所提供的细胞穿膜肽LTA2，采用基因工程重组蛋白表达方法制备。

作为一个优选方案，所述药物运输载体可携带核酸、多肽、蛋白质、糖类、脂质、和/或小分子物质以细胞内吞的方式进入细胞。

作为一个优选方案，所述药物为抗肺癌、抗乳腺癌和抗结肠癌药物。

为实现本发明第二个目的，本发明公开以下技术方案：LTA₂肽段在制备细胞内药物运输载体中的应用。

作为一个优选方案，所述药物运输载体可携带核酸、多肽、蛋白质、糖类、脂质、和/或小分子物质以细胞内吞的方式进入细胞。

作为一个优选方案，所述药物为抗肺癌、抗乳腺癌和抗结肠癌药物。