[发明专利]一种酶法降解几丁质生产N‑乙酰氨基葡萄糖的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶法降解几丁质生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法。

背景技术

甲壳素(C₈H₁₃O₅N)n ，又名几丁质、甲壳质或壳多糖，由N-乙酰氨基葡萄糖通过糖苷键结合起来的聚合物，是一种含氮多糖类物质，为虾、蟹、昆虫等甲壳的重要成分。分子结构为长链状，由8000个单体组成的多糖，为自然界的一种半透明而坚固的材料。几丁质能通过化学法和生物酶法被降解成几丁寡糖及单糖，目前常用的化学降解法具有环境污染巨大、反应效率低、产品质量差、过程不易控制等缺点，已逐步被生物酶法降解几丁质取代。

N-乙酰氨基葡萄糖是壳多糖保健食品系列中最新的第三代保健机能性食品添加剂，可作低热量的甜味剂，也可作为抗癌、防癌、降血脂、降血压的食品添加剂。主要用于临床增强人体免疫系统的功能，抑制癌细胞或纤维细胞的过度生长，对癌症和恶性肿癌能起到抑制和治疗作用，此外，N-乙酰氨基葡萄糖对于骨关节炎及关节疼痛也有治疗作用。

目前报道的微生物发酵所产几丁质酶酶活普遍较低，在降解几丁质生产 N-乙酰氨基葡萄糖时转化效率低，难以满足工业化生产需求。因此对酶液进行浓缩，提高降解效率是很有必要的。传统酶浓缩方法包括盐沉，反渗透等方法，存在诸多问题：盐沉过程酶活损失大，操作繁琐；凝胶吸附法成本高昂，难以推广。此外，几丁质降解产物既可以作为菌体利用的碳源又可作为氮源，转化过程难以控制，极易染菌。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种酶法降解几丁质生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法，通过调控优化微生物产酶、对酶液进行浓缩，转化过程中采取抑菌措施，进而能高效、安全的降解几丁质生产几丁寡糖产品。

为解决现有技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种酶法降解几丁质生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法，包括以下步骤：

步骤1，微生物发酵产几丁质酶

选产几丁质酶的菌株作为种子，在37℃、200 rpm下培养得种子液，再以体积分数5%~10%接种量接入装有产酶发酵培养基的发酵罐，装液量40-60%，培养温度24℃~37℃，转速为200~500 rpm，通气量1vvm~3vvm，初始pH7.0~8.0，发酵72~96h后收集发酵液；

步骤2，粗酶液的获得

将步骤1获得的发酵液低温高速离心，分离菌体，收集上清液，得到几丁质酶粗酶液，低温贮存，备用；

步骤3，浓缩酶液

将步骤2中所得得到的几丁质粗酶液，低温透析浓缩得到浓缩酶液，测粗酶液和浓缩酶液酶活，计算回收率；

步骤4，生产N-乙酰氨基葡萄糖

利用步骤3中获得的浓缩酶液无菌转化几丁质，其中，转化体系的温度为25-37℃，搅拌速度为200 rpm，转化24-72 h，液相法检测N-乙酰氨基葡萄糖浓度。

作为优选的是，所述产几丁质酶的菌株为Chitinolyticbacter meiyuanensisSYBC-H1 (CGMCC NO：3438；ATCC BAA-2140)或Chitinibactersp.GC72（CCTCC NO ：M2014113）。

作为优选的是，步骤3，浓缩用变色硅胶或无色硅胶与变色硅胶的混合物。

作为优选的是，步骤3，浓缩温度为4℃，浓缩时间2-12h。

作为优选的是，步骤4，还包括占转化体系体积分数为0.1-0.2%的抗生素，所述所述抗生素为卡纳或四环素。

测酶活所用方法为DNS法：将1.9 mL 0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）和0.5 mL 1%的胶体几丁质加100μl酶液组成的反应体系，37℃水浴30 min，沸水浴5 min中止反应，加入2 mL DNS试剂，沸水浴5 min，冷却至室温，离心后取上清液，在波长535 nm下测吸光度，以灭活的等量酶液作空白对照。

有益效果

（1）利用硅胶及透析袋浓缩几丁质酶液，较传统浓缩酶液的方法具有操作简单，成本低，高酶活回收率的优势。硅胶吸水快，能很直观看到吸水情况，节约生产时间，不需要外界能量辅助，且能重复利用。

（2）采用高浓度酶液生产N-乙酰氨基葡萄糖效率高，快速，大大降低了生产成本。

（3）采用往转化体系中加入适量抗生素，可有效地防止染菌，降低了安全隐患。

（4）转化体系是经过实验优化，转化效率高。

具体实施方式