[发明专利]抗许氏平鲉血清免疫球蛋白M的单克隆抗体及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体及其制备方法与应用，具体涉及一种抗许氏平鲉（Sebastes schlegeli）血清免疫球蛋白M的单克隆抗体及其制备方法与应用，属于鱼类分子免疫学技术领域。

背景技术

鱼类具有与高等脊椎动物相似的免疫防御系统，其免疫系统由免疫器官、免疫细胞和免疫因子组成，是鱼体执行免疫功能的机构, 同时也是产生免疫应答的物质基础。对鱼类免疫系统及其免疫应答规律的认识有助于鱼类病害的免疫防治。

鱼类免疫球蛋白是鱼体特异性体液免疫应答的主要介质。受病毒和细菌等病原刺激后，鱼体可产生大量的免疫球蛋白，这些免疫球蛋白可与抗原表面结合，阻止病原对宿主细胞的侵袭和诱导鱼体对病原的识别反应，进而清除病原。因此，利用抗许氏平鲉免疫球蛋白M的单克隆抗体，通过检测许氏平鲉血清中该特异性抗体，可对许氏平鲉疾病的早期诊断和疫苗使用的效果进行评价，也可为许氏平鲉免疫系统及免疫应答动态等研究提供有力工具，对许氏平鲉疾病的预防及治疗具有重要理论和现实意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种由杂交瘤细胞分泌的抗许氏平鲉血清免疫球蛋白M的单克隆抗体。

本发明的另一个目的是提供上述抗许氏平鲉血清免疫球蛋白M单克隆抗体的制备方法与应用。

本发明的目的是由以下技术方案实现的：一种抗许氏平鲉血清免疫球蛋白M的单克隆抗体，所述的单克隆抗体是由名称为：杂交瘤细胞株Ss-IgM，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武汉大学，保藏号为：CCTCC NO：C2014162，保藏日期为：2014年9月2日的杂交瘤细胞分泌的。

在倒置显微镜下观察，生长状态良好的该杂交瘤细胞分裂旺盛、外观饱满、浑圆、折光性强、细胞大小均一、贴壁良好；该杂交瘤细胞有无限分裂增生能力；长势良好的该杂交瘤细胞常规培养2-3天，其培养基由桃红色转变为黄色，其中含有该杂交瘤细胞分泌的大量抗许氏平鲉血清免疫球蛋白M的单克隆抗体。

一种所述抗许氏平鲉血清免疫球蛋白M单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：将许氏平鲉血清经盐析结合柱层析法纯化得到许氏平鲉血清免疫球蛋白M；以纯化的许氏平鲉血清免疫球蛋白M为抗原免疫BALB/c小鼠；融合被免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞；经免疫学检测筛选方法，筛选出分泌抗许氏平鲉血清免疫球蛋白M单克隆抗体的杂交瘤细胞Ss-IgM，其分泌的抗体即为抗许氏平鲉血清免疫球蛋白M的单克隆抗体。

所述的盐析结合柱层析法，是将许氏平鲉血清经饱和硫酸铵分步盐析后，经HiTrap® Protein A亲和层析柱进一步纯化得到许氏平鲉血清免疫球蛋白M。

所述的免疫学检测筛选方法是间接酶联免疫法、间接免疫荧光法和转印免疫印迹法；其中所述的间接酶联免疫法是将细胞融合后所得的杂交瘤细胞培养上清液与纯化的许氏平鲉血清免疫球蛋白M于96孔酶标板中反应；继而加入辣根过氧化物酶（AP）标记的羊抗鼠抗体；405 nm工作波长测定各孔光吸收值，筛选抗许氏平鲉免疫球蛋白M的单克隆抗体。所述的免疫荧光法是杂交瘤细胞Ss-IgM分泌的单克隆抗体与许氏平鲉外周血白细胞悬液于培养板孔中反应；继而加入异硫氰荧光素（FITC）标记的羊抗鼠抗体；取部分细胞滴于载玻片上，用荧光显微镜观察，确定该单抗可与淋巴细胞表面免疫球蛋白M发生特异性结合。所述的转印免疫印迹法是将杂交瘤细胞Ss-IgM分泌的抗许氏平鲉血清免疫球蛋白M的单克隆抗体与转移至硝酸纤维素膜的许氏平鲉血清免疫球蛋白M反应，确定该单抗的抗原决定簇位于分子量为77 kDa的许氏平鲉免疫球蛋白M的重链上。

所述的杂交瘤细胞Ss-IgM分泌的单克隆抗体的应用为:用灭活爱德华细菌注射免疫许氏平鲉，于免疫后第7,14,21,28, 35和42天收集血清，以及在免疫后第21和35天提取外周血白细胞,利用间接酶联免疫法检测各时间点血清中抗爱德华细菌特异性抗体，利用流式细胞术检测外周血白细胞中表面免疫球蛋白M阳性淋巴细胞比例变化。