[发明专利]一种提高乌塌菜小孢子胚胎发生率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种植物小孢子胚胎的培养方法，尤其涉及的是一种提高乌塌菜小孢子胚胎发生率的方法。

背景技术

目前，小孢子培养技术已在大白菜、甘蓝、小青菜等十字花科芸薹属蔬菜上有一定的应用，而乌塌菜游离小孢子的培养少有报道，由于基因型的差异，并不能把大白菜等芸薹属蔬菜的游离小孢子培养技术照搬照抄的应用于乌菜。而在少有的关于乌塌菜游离小孢子培养的报道中，都存在出胚基因型比率低，产胚率低等难题，目前为止并没有一种完全适用于乌塌菜小孢子的系统高效的培养方法。中国专利文献201210047243.1中提供了一种提高结球甘蓝胚胎出生率的培养方法，通过将结球甘蓝和油菜花蕾混合进行小孢子培养，从而提高了结球甘蓝的胚胎出生率。但结球甘蓝与油菜属于芸薹属不同种类植物，在受基因型影响严重的小孢子培养中，很难找到同时适合两种植物的培养条件，所以此方法适用性较窄。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种提高乌塌菜小孢子胚胎发生率的方法，以解决乌塌菜小孢子胚胎发生率低、胚基因型比率低的技术问题。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种提高乌塌菜小孢子胚胎发生率的方法，包括以下步骤：

(1)同时选择易出胚品种、难出胚品种/弱出胚品种的乌塌菜植株的盛花期花蕾，将易出胚品种的花蕾与难出胚品种/弱出胚品种的花蕾混合，洗净后，置于4℃下预处理24h，再对混合的花蕾进行消毒，获得消毒后的花蕾，其中，所述易出胚品种为出胚率高于2个胚/蕾的乌塌菜品种，难出胚品种为出胚率为0的乌塌菜品种，弱出胚品种为介于易出胚品种和难出胚品种之间的乌塌菜品种；

(2)将步骤(1)的消毒后的花蕾加入pH5.8的B5提取液中进行提纯，获得提纯后的小孢子；

(3)将步骤(2)的提纯后的小孢子悬浮在pH5.8的1/2NLN-13培养基中，33℃下热激12h后，室温下静置暗培养，得到肉眼可见的胚状体；

(4)将步骤(3)的胚状体振荡培养，获得子叶型胚；将子叶型胚经过分化培养和生根培养，最终获得再生植株。

所述步骤(1)中，易出胚品种的花蕾与难出胚品种/弱出胚品种的花蕾个数比为1：1。

所述步骤(1)中，洗净后置于4℃下预处理24h的具体步骤为：将混合的花蕾置于网漏中流水下冲洗30min，用脱脂纱布包裹，保持混合的花蕾为湿润状态，再置于4℃下低温预处理24h；流水冲洗是为了洗净花蕾表面的杂质病菌，更好地消毒；低温预处理可以引起花药内源激素的变化，进而影响愈伤组织的形成，同时，低温预处理能够引起小孢子的孤立化，花药壁细胞核绒毡层在低温过程由逐渐退化解体，低温预处理还能使绝大多数小孢子保持其生活力。

所述步骤(1)中，消毒的步骤为：将花蕾先用体积比为75％的酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，再用质量比为2％的次氯酸钠溶液进行表面消毒8min，无菌水再冲洗3次。

所述步骤(2)中，B5提取液的提纯步骤为：将加入B5提取液中的花蕾碾压，然后400目过滤，收集滤液，1100rpm下离心3min，弃上清，再加入B5提取液，1100rpm下离心3min，重复2次，获得的沉淀即为提纯后的小孢子。

所述步骤(3)中，提纯后的小孢子在1/2NLN-13培养基中的悬浮密度为1×10⁵个/ml。

所述步骤(3)中，1/2NLN-13培养基为由1/2NLN-13培养基中添加0.3mg/L的细胞分裂素6-BA、0.1mg/L的α-萘乙酸α-NAA和500mg/L的活性炭AC配制而成，所述1/2NLN-13为大量元素减半的NLN-13，所述NLN-13为每100ml的NLN培养基中添加13g蔗糖的液体培养基。

所述步骤(4)中，胚状体振荡培养的转速为55rpm。

所述易出胚品种为塌地乌1号，弱出胚品种为塌地乌6号，难出胚品种为塌地乌2号。

本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种提高乌塌菜小孢子胚胎发生率的方法，该方法将易出胚的花蕾与难出胚或弱出胚的花蕾混合培养，相比于单一培养，能够有效诱导难出胚品种产胚率和提高弱出胚品种的胚胎发生率和植株再生率，解决了弱出胚品种的胚胎发生率和出胚基因型比率低的技术问题，同时解决了难出胚品种无法利用小孢子培养的方式获得植株的技术障碍，对乌塌菜小孢子培养具有重要意义。

具体实施方式