[发明专利]以粘蛋白1和生存素为靶点的肿瘤DNA疫苗及病毒载体疫苗

说明书

本申请为分案申请，其原申请的申请日为2009年12月4日，申请号为200910252427.X，名称为“以粘蛋白1和生存素为靶点的肿瘤DNA疫苗及病毒载体疫苗”。

技术领域

本发明涉及肿瘤DNA疫苗和病毒载体疫苗领域。具体地说，本发明涉及重组DNA载体VR-S8和VR-MS、重组腺病毒Ad-S8和Ad-MS及重组痘病毒MVA-MS疫苗，以及DNA疫苗和病毒载体疫苗以及病毒载体疫苗之间免疫方式的优化组合在制备抗肿瘤疫苗中的用途。

背景技术

生存素(Survivin)是抑制凋亡蛋白(IAP)家族成员，具有抗凋亡和调控细胞分裂的双重功能，广泛表达于各种胚胎组织和癌细胞中，但在正常终末分化细胞中不表达。这些特点使生存素成为肿瘤发生，发展和治疗等领域中的一个新靶点。

目前的研究表明生存素在肿瘤基因治疗中具有潜在价值：它的肿瘤特异性表达，及其与预后不良、药物抗性和病人生存期缩短等呈正相关。针对生存素及其突变体等进行的肿瘤免疫治疗已成为人们关注的热点。目前国内外策略有(参见Li,F.et al.,2006；Li,F.,2003；Altieri,D.C.,2008)：(1)利用生存素启动子的肿瘤特异性表达进行的肿瘤靶向基因治疗；(2)针对生存素本身的治疗策略：a)生存素的反义或全长的cDNA或反义核苷酸表达载体策略，比较适合生存素的功能研究和前临床研究，但用全长的生存素可能有潜在的危险；b)生存素功能阴性突变体(dominant negative mutant，DNM)策略，主要是SurvT34A和SurvC84A，但此方案可能不适用于直接的癌症治疗；c)生存素核酶方案，即用生存素mRNA特异性核酶剪切生存素mRNA以降低生存素的表达，此方案也是一种有效的研究工具，但不适用于癌症临床治疗；d)生存素RNAi技术，目前的研究表明：RNAi能有效的使哺乳动物基因表达沉默，可用于基因功能研究，但昂贵的费用限制其临床应用；e)用小分子有机物或小肽抑制生存素的表达或干扰其功能；f)用生存素特异性表位的免疫治疗，这是一个很吸引人的领域，但只用生存素的小肽，免疫原性可能不高。

因为生存素具有抗凋亡的功能，如果用其全长来设计疫苗可能存在安全隐患，根据国内外策略的优点和弊端拟采用生存素抗凋亡功能缺失剪切体来设计疫苗，在保证其抗凋亡功能缺失的情况下尽量保存长度以提高免疫原性。因此本发明采用生存素的抗凋亡功能缺失剪切体来设计疫苗。生存素在体内是以二聚体形式起作用的，它N-端第6、第7和第10位的三个氨基酸是形成二聚体的关键氨基酸(参见Shi,Y.et al.,2000)；生存素的第5位至第14位氨基酸是HLA-A2的特异性抗原表位(参见Andersen,M.H.et al.,2001)，基于这两点本发明首次设计了剪切体S8(即切去生存素N-端7个氨基酸)，希望可以破环它的二聚体结构，从而使其缺失抗凋亡的功能。因此以S8为靶点来设计疫苗可能会提高疫苗的安全性。

粘蛋白1(MUC1)是粘蛋白家族成员，是跨膜糖蛋白，存在于正常腺管上皮细胞及其来源的肿瘤细胞表面，由多肽核心和侧枝糖链构成。其核心肽胞外段含有数目不等的串联重复区(VNTR)。正常组织中MUC1分布于腺管上皮细胞分泌极，与免疫细胞相对隔离，糖基化丰富；而在肿瘤组织，其广泛分布并异常丰富地表达于细胞表面，糖基化不完全，因此暴露出正常情况下隐蔽的表位，成为免疫细胞攻击的靶点，并且表达增强，可达正常细胞的100倍以上，因此MUC1是较理想的抗肿瘤靶分子。

MUC1 VNTR中的PDTRP序列是B细胞及T细胞共同识别的表位，可与MUC1特异性抗体及细胞毒性T淋巴细胞(CTL)相结合，故称这个最具免疫原性的部位为免疫显性结构域，因此，目前大部分利用MUC1研究免疫治疗的都是集中在VNTR区域(参见Singh,R.et al.,2007；Persson,J.et al.,2006；Xing,P.X.et al.,1992；Tang,C.K.et al.,2008；Tang,C.K.et al.,2008)。从发现MUC1到现在已用其进行了很多的疫苗研究工作，并有一些疫苗已经进入人类临床研究阶段，但大多数都是传统的多肽类、蛋白类或树突状细胞(DC)类疫苗，这些疫苗大多都存在免疫原性差或制备困难等问题；进入临床的基因疫苗主要是重组痘病毒疫苗，虽然没有检测到毒性，但直接用重组痘病毒疫苗初免-加强还是存在较大的安全隐患，而且产生的临床效果也不是很理想；DNA载体疫苗由于免疫原性较弱目前还基本处于临床前研究阶段。