[发明专利]一种酶解牛源性生物骨材料中残留α-Gal抗原的表征方法

权利要求书

1.一种酶解牛源性生物骨材料中残留α-Gal抗原的表征方法，其特征是，利用高速低温匀质法对经酶解法处理后的牛源性生物骨材料进行研磨处理后加入BSA溶液，得到一定浓度的匀浆液；然后通过抑制ELISA法检测并计算该浓度下牛源性生物骨材料中α-Gal抗原对应M86抗体结合抑制率的IC₅₀值及阳性对照品的IC₅₀值，得出待测牛源性生物骨材料中α-Gal抗原的清除率，以清除率表征酶解牛源性生物骨材料中残留α-Gal抗原。

2.如权利要求1所述的一种酶解牛源性生物骨材料中残留α-Gal抗原的表征方法，其特征是，包括以下步骤：

(1)牛源性生物骨材料待测样品的处理

取酶解牛源性生物骨材料样品置于匀质仪器中，在转速6500-8000r/min下，采用液氮冷却研磨至样品粒径为≤90μm，加入1％BSA溶液；取匀浆液进行倍比梯度稀释，至少4个梯度，备用；取未经酶解的牛源性生物骨材料按同样的方法制成同样浓度的匀浆液，进行同样的倍比梯度稀释后，备用；

(2)最佳M86抗体稀释度的测定

在预先包被有α-Gal抗原的每个微孔板中分别加入等体积倍比稀释的M86抗体溶液，混匀，室温振荡孵育后洗板；加入HRP标记的抗小鼠二抗，37℃振荡孵育后洗板；显色后，用酶标仪读取吸光度值，绘制吸光度值与对应M86稀释度的反应曲线，取反应曲线刚进入平台区稀释度的两倍稀释度值作为最佳稀释度；

(3)间接抑制ELISA法检测上清溶液中剩余M86抗体

在每个稀释度的待测样品中分别加入最佳稀释度的M86抗体溶液；混匀，4℃震荡孵育过夜，离心后取上清液备用；在96孔板的相应孔中加入过量的α-Gal抗原溶液，4℃孵育过夜后洗板；分别取已制备的上清液加入相应α-Gal抗原包被的96孔板中，37℃振荡孵育后洗板；加入HRP标记的抗小鼠二抗，37℃振荡孵育后洗板；显色后，用酶标仪读取吸光度值，得到各个稀释度下待测样品的吸光度值；用同样的方法得到溶剂对照的吸光度值及各个稀释度下的阳性对照的吸光度值；

(4)数据分析

①根据各个稀释度下待测样品及阳性对照的吸光度值以及溶剂对照的吸光度值，按下述公式计算各个稀释度下待测样品及阳性对照的M86结合抑制率；

M86结合抑制率，

式中：

a—待测样品及阳性对照的吸光度OD值；

b—溶剂对照的吸光度的OD值；

②根据各个稀释度下阳性对照的抑制率及其初始浓度，用改良寇式法计算得出阳性对照的IC₅₀；

③根据各个稀释度下待测样品的抑制率及其初始浓度，用改良寇式法计算得出待测样品的IC₅₀，然后按下述公式计算酶解牛源性生物骨材料中α-Gal抗原的清除率：

α-Gal抗原的清除率，

式中：

x—待测样品的IC₅₀；

y—阳性对照的IC₅₀。

3.如权利要求2所述的一种酶解牛源性生物骨材料中残留α-Gal抗原的表征方法，其特征是，所述步骤(1)的样品处理方法为：取100mg酶解牛源性生物骨材料样品于Bertin Precellys24匀质仪器的1.5mL研磨瓶中，加8粒3mm和1粒5mm陶瓷磁珠，转速为6800r/min，30s/次，液氮冷却研磨5次，间隔时间30s，至样品全部粉碎，置于冰上备用；取待测样品放入离心管中，加入1％BSA溶液；取匀浆液进行倍比梯度稀释，至少4个梯度。

4.如权利要求2所述的一种酶解牛源性生物骨材料中残留α-Gal抗原的表征方法，其特征是，所述步骤(2)的M86抗体溶液倍比稀释设5-10个稀释度，稀释度在1:25与1:3200之间。

5.如权利要求4所述的一种酶解牛源性生物骨材料中残留α-Gal抗原的表征方法，其特征是，所述步骤(2)具体为：在预先包被有100μL/孔α-Gal抗原的每个微孔板中分别加入100μL倍比稀释的M86抗体溶液；混匀，室温振荡孵育1.5h，用洗液洗板3次；加入HRP标记的抗小鼠二抗，37℃振荡孵育1h后，用洗液洗板3次。显色后，用酶标仪在450nm波长处读取吸光度值，绘制吸光度值与对应M86稀释度的反应曲线，取反应曲线刚进入平台区稀释度的两倍稀释度值作为最佳稀释度。