[发明专利]一种制备绒毛膜间充质干细胞的方法

权利要求书

1.一种制备绒毛膜间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)无菌采集胎盘，采集后0～30min内用胎盘清洗液冲洗外表1-3次，将胎盘浸泡于胎盘清洗液中；

2)48h内运至实验室，将胎盘再次用清洗液清洗1-3次，剪去脐带，撕除羊膜，剪取羊膜下0～1cm厚度范围内绒毛膜组织，清洗干净后，放入清洗液浸泡0～30min，然后将绒毛膜组织剪碎成0.5～4mm³大小的组织块；

3)通过胶原酶消化法从绒毛膜组织块获取绒毛膜间充质干细胞；

4)使用无血清培养基培养绒毛膜间充质干细胞，其中P0代绒毛膜间充质干细胞长满至80%密度后，使用0.25%胰酶消化，消化时间为3-5min，P0代之后，细胞在传代操作后48-72h内进行传代，要求传代时细胞密度80%-90%，传代后细胞按（3-8）×10³个/cm²密度接种，培养过程中注意观察培养基PH值变化，一旦变黄添加新鲜培养基并去除培养器皿中等量旧培养基，细胞从P0代传代，传至P1～P30中间的任何一代次；

    其中，

    所说的步骤1）和步骤2）中清洗液为0.9%的生理盐水；

    所说的步骤3）中的胶原酶消化法中所用的胶原酶为终浓度为1-5mg/ml的胶原酶II；

所说的步骤4）中的无血清培养基由以下成分组成：DMEM/F12、血小板源生长因子PDGF-BB、 碱性成纤维细胞生长因子bFGF、 转化生长因子β1 （TGF）-β1、表皮生长因子EGF和转铁蛋白Transferrin；其中，PDGF-BB含量为50～100 ng/mL；bFGF含量为0～50 ng/mL；(TGF)-β1含量为0～20ng/mL；EGF含量为0～30 ng/mL;Transferrin含量为2.0～4.5 mg/mL。

2.根据权利要求1所述的制备绒毛膜间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的步骤1）和步骤2）中的清洗液还含有抗生素，所说的抗生素为青霉素、链霉素或两性霉素B。

3.根据权利要求1所述的制备绒毛膜间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的步骤3）中的酶消化法的步骤如下：将绒毛膜组织块放入37℃温度中，振荡消化15～60min，加入组织块体积1-5倍体积生理盐水，2500转离心5min，去上清，将底部消化后产物，转入培养器皿，按1ml绒毛膜组织块加入10ml无血清培养基，所述的步骤3）中的无血清培养基由以下成分组成：DMEM/F12、血小板源生长因子PDGF-BB、 碱性成纤维细胞生长因子bFGF、 转化生长因子β1 （TGF）-β1、表皮生长因子EGF和转铁蛋白Transferrin；其中，PDGF-BB含量为50～100 ng/mL；bFGF含量为0～50 ng/mL；(TGF)-β1含量为0～20ng/mL；EGF含量为0～30 ng/mL;Transferrin含量为2.0～4.5 mg/mL。

4.根据权利要求3所述的制备绒毛膜间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的步骤3）中的无血清培养基由以下成分组成：DMEM/F12+80ng/mL PDGF-BB+ 20ng/mL bFGF+ 10ng/mL (TGF)-β1+10ng/mL EGF+3.0mg/mL转铁蛋白。

5.根据权利要求3或4所述的制备绒毛膜间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的步骤3）中的无血清培养基中还添加有抗生素，所说的抗生素为青霉素、链霉素或两性霉素B。

6.根据权利要求1所述的制备绒毛膜间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的步骤4）中的无血清培养基由以下成分组成：DMEM/F12+80ng/mL PDGF-BB+ 20ng/mL bFGF+ 10ng/mL (TGF)-β1+10ng/mL EGF+3.0mg/mL转铁蛋白。

7.根据权利要求1或6所述的制备绒毛膜间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的步骤4）中的P0代细胞培养用的无血清培养基中还添加有抗生素，所说的抗生素为青霉素、链霉素或两性霉素B。

8.根据权利要求1所述的制备绒毛膜间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的绒毛膜间充质干细胞的冻存方法如下：每10⁶-10⁷细胞加入1ml冻存液，放入冻存盒，转入-80℃冰箱，12～24h后转入-196℃液氮或气氮中保存备用，所述冻存液由基础液和渗透性冷冻保护剂组成，所说的渗透性冷冻保护剂浓度为1-1.4 mol/L,所说的基础液为培养液DMEM/F12；所说的渗透性冷冻保护剂为二甲基亚砜。