[发明专利]一种1型鸭甲肝病毒DNA-Launched感染性克隆的构建方法

说明书

(一)技术领域

本发明所涉及的是一种1型鸭甲肝病毒DNA-Launched感染性克隆的构建方法，属于病毒分子生物学领域。

(二)背景技术

1型鸭甲肝病毒是一种感染1-3周龄雏鸭为主的高传染性、高死亡率的单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科(Picornaviridae)禽肝病毒属(Avihepatovirus)。该病毒全长7700bp，包含5’非编码区(untranslated region,UTR)、一个大的开放阅读框(open-reading frame,ORF)和3′UTR(3’untranslated regions)和poly(A)尾。5′UTR没有帽子结构，但有内部核糖体进入位点(the internal ribosome enter site,IRES)。

目前，反向遗传学技术是深入开展鸭甲肝病毒的致病机理及蛋白功能的研究等方面研究的最有力手段。RNA病毒反向遗传系统是指以RNA病毒的基因组的cDNA为模板，分段定向克隆到载体上，体内或体外转录后重新拯救出活病毒或类似病毒物质，也成为RNA-Launched感染性克隆。对于单股正链的DHAV-Ⅰ而言，研究的核心是构建病毒的感染性cDNA分子克隆，即在获得病毒基因组全序列的基础上，借助于某些载体，将病毒的全长cDNA分子克隆入载体中，同时将RNA合酶的启动子元件序列也无缝插入分子克隆中，通过体外转录方法得到病毒mRNA，然后转染敏感细胞系，拯救出与母本病毒具有相似生物特性的活病毒。该方法具有以下弊端：1.为了确保病毒的开放阅读框被准确转录、翻译，RNA聚合酶必须无缝添加到DHAV-1序列前，即RNA聚合酶与病毒cDNA序列间不能有多余碱基，这样就使得长片段RNA聚合酶的添加异常困难。2.需要进行体外转录：鸭甲肝病毒Ⅰ型RNA-Launched感染性克隆构建完成后，首先需要利用添加在病毒序列尾端的限制性内切酶将重组阳性质粒线性化，继而将线性化的重组质粒进行体外转录，最后将体外转录产物转染易感细胞。体外转录具有操作难度大、无法保证转录出的mRNA完整性等缺点。3.转染效率低：体外转录的产物为单股、线性化的mRNA，转染效率较质粒低。4.经济负担大：目前国内外出售的体外转录试剂盒价格昂贵，增加试验经费。

(三)发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种1型鸭甲肝病毒DNA-Launched感染性克隆的构建方法，是一种操作简便、高效、节约的感染性克隆构建方法。

本发明在构建过程中，通过PCR方法在1型鸭甲肝病毒核酸序列的5′端和3′端分别添加了具有自我剪切性质的核酶序列hammerhead ribozyme(ACA TCA TCT GAT GAG TCC GTG AGG ACG AAA CGG TAC CCG GTA CCG TCA T)和hepatitis delta virus ribozyme(GTC CCA TTC GCC ATT ACC GAG GGG ACG GTC CCC TCG GAA TGT TGC CCA GCC GGC GCC AGC GAG GAG GCT GGG ACC ATG CCG GCC)。该重组质粒可以直接转染细胞，转录出两端带有核酶序列的mRNA。上述核酶序列在Mg²⁺存在的条件下，可以实现自我剪切，故可得到病毒mRNA。

一种用于构建1型鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus type 1,DHAV-1)DNA-Launched感染性克隆的方法，包括以下步骤：

A、根据DHAV-1的LY0801株(GenBank登录号为FJ436047.1)RNA-launched感染性克隆和载体pIRES2-EGFP(Clontech公司)的序列，设计引物进行PCR反应。

5HeadRibo-F：5’-ACA TGG CGC GCC ACA TCA TCT GAT GAG TCC GTG AGG ACG AAA CGG TAC CCG CGT GAG GAC GAA ACG GTA CCC GGT ACC GTC ATT TTG AAA GCG GGT GCA TGC ATG GCC AT-3’

5HeadRibo-R：5’-AGG TGG ATC CAC TAT TGT CAC CTT C-3’