[发明专利]一种酒曲发酵产凝乳酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种酒曲发酵产凝乳酶的制备方法。

背景技术

江米酒是我国南方的一种传统食品，具有凝乳作用，其凝乳作用是由江米酒中所含有的蛋白酶引起的，属于酶凝固。江米酒中的凝乳酶是江米酒发酵过程中发酵剂酒曲中微生物的代谢产物，属于微生物凝乳酶。

凝乳酶是干酪生产过程中的关键性酶，是食品领域中的重要酶制剂，其在凝乳中的主要作用是专一性的水解κ-酪蛋白多肽链中Phe105-Met106之间的肽键，从而使酪蛋白颗粒之间发生聚沉。凝乳酶的凝乳活性受到反应条件如酶浓度、牛奶的温度和pH值以及钙离子浓度等的影响。凝乳酶的主要来源有3种，分别为动物来源、植物来源和微生物来源。微生物源的凝乳酶不受区域、时间等的限制，且具有成本低、产量高等优点，受到越来越多的重视。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种制备凝乳酶的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将酒曲、糯米基质和水混匀，发酵，收集发酵产物，即得到凝乳酶；

所述酒曲的凝乳活力为4.90±0.6Su/mL；

所述酒曲的凝乳活力为其江米酒发酵产物中的凝乳酶凝乳活力。

所述糯米基质按照如下方法制备：将糯米和水混匀，加热，得到糯米基质。

上述方法中，

所述酒曲的蛋白水解活力为3.05±0.81Su/mL；

所述酒曲与所述糯米基质的质量比为3-6：100，所述酒曲与所述糯米基质的质量比具体为5.7：100。

上述方法中，所述发酵时间为5-7天，所述发酵时间具体为72h。

上述方法中，所述发酵采用摇床震荡的方式，所述摇床的转速为80-180rpm，所述摇床的转速具体为120rpm，其旋转半径为13mm。

上述方法中，所述发酵的温度20-35℃，所述发酵的温度具体为30℃；

所述发酵的体系初始pH值为4.5-6.5，所述发酵的体系初始pH值为5.0。

所述水和所述糯米基质质量比为50:100；

所述糯米基质由所述糯米和水按照500g所述糯米：1L水的配比制成。

上述方法中，在所述收集发酵产物后，还包括如下步骤：

1)过滤所述发酵产物，收集滤液，得到含有凝乳酶滤液；

2)向所述含有凝乳酶滤液中加入乙醇得到混合体系A，使乙醇在所述混合体系A中的体积百分含量为50％，再收集上清液；

3)向所述上清液中加入乙醇得到混合体系B，使乙醇在所述混合体系B中的体积百分含量为60％，离心收集上清液；

4)向3)处理得到的上清液中加入乙醇得到混合体系C，使乙醇在所述混合体系C中的体积百分含量为70％，离心收集沉淀。

上述方法中，在收集所述沉淀后，还包括如下步骤:将所述沉淀溶解后经凝胶柱层析，收集洗脱液，得到凝乳酶。

所述溶解所需的溶剂为0.05mol/L pH5.8的PBS溶液(配方：NaCl 35g,KCl 1g,KOH1.2g,K₂HPO₄9g,添加蒸馏水定容至1L，用乙酸调节pH至5.8)。

上述方法中，所述凝胶柱层析的凝胶柱介质为Sephadex G75；

所述凝胶柱层析采用的洗脱缓冲液为浓度为0.05mol/L、pH值为5.8的PBS溶液；

所述收集洗脱液为收集保留时间为100min-130min的洗脱液。

由上述方法制备的凝乳酶也是本发明保护的范围；

或由所述凝乳酶制备的凝乳酶制剂。

上述凝乳酶具有如下1)-3)中至少一种酶学特征：

1)所述凝乳酶的最适反应温度为35℃，

2)所述凝乳酶的最适反应pH值5.4；

3)所述凝乳酶的活性能被Ca²⁺促进。

本发明实验证明，本发明提取出了一种对高温具有较低耐受性的凝乳酶，该凝乳酶来自江米酒食品，具有较高的C/P和绝对的安全性，同时在35℃下具有较高的凝乳活力，而温度升高(>45℃)凝乳活力明显丧失。此特性可避免干酪制作时热烫灭酶不充分造成的干酪风味苦涩等问题，从而提高了其在干酪生产中的实际应用价值。

附图说明

图1为不同发件条件对酒曲发酵产凝乳酶的影响

图2为不同碳源氮源的添加对酒曲发酵产凝乳酶的影响

图3为酒曲发酵产凝乳酶的响应面图及高等线图

图4为乙醇分级沉淀SDS-PAGE电泳图