[发明专利]一种人类α防御素多肽酶联免疫吸附试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及涉及生物技术领域，特别涉及一种人类α防御素多肽酶联免疫吸附试剂盒、制备与检测方法。

背景技术

防御素蛋白肽(Defensins)属于抗菌肽家族，广泛存在于包括植物、无脊椎动物和脊椎动物在内的多种生物体。防御素蛋白肽均为分子量2-6kDa的阳离子小分子短肽，含保守的6个半胱氨酸残基，形成3个典型的分子内二硫键，分为α-防御素和13-防御素两大类。α-防御素主要存在于人类嗜中性粒细胞的嗜天青颗粒中，亦被称为人类嗜中性粒细胞肽(Human neutrophol peptides，HNP)。人类嗜中性粒细胞防御素主要有3种，即HNP1、HNP2和HNP3，具有促进中性粒细胞趋化、增强巨噬细胞吞噬功能、调节补体活性、刺激炎性因子的表达与释放，以及趋化树突状细胞和T细胞等生物学作用，在机体的天然免疫应答和获得性免疫应答中发挥非常重要的作用。大量研究表明，α防御素蛋白表达异常或功能受损与各种感染免疫性疾病(如重症脓毒症和炎症性肠病等)的发生发展密切相关，并且在败血症、肺炎、慢性阻塞性肺病等多种疾病的发病和调节中起了关键性的作用。临床研究证明，α防御素(HNP)的水平与上述疾病的病情进展、严重程度及预后密切相关，可以发展为新的临床诊断与病情监测指标。

现在检测HNP的方法主要有免疫组化法、免疫印迹(Western blot)及酶联免疫吸附测定方法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)。各种方法相互验证，同时又存在灵敏度、专业性、设施设备条件及成本的影响。目前，以血清学反应原理为基础的ELISA方法是被广泛接受和推广的方法。与其他检测方法相比，ELISA检测方法具有成本低、检测设备简单、快速高效等优点，并在不断改进过程中，形成了竞争ELISA，非竞争ELISA，单抗体ELISA、微波ELISA以及双抗体夹心ELISA方法。目前，市售的检测HNP的双抗夹心试剂盒，普遍存在检测范围窄、灵敏度低、价格昂贵等缺点。而制备该种试剂盒的关键，是得到良好的包被抗体和检测抗体。包被抗体以及检测抗体的灵敏度决定了双抗夹心试剂盒的检测范围及灵敏度。

因此，研制高灵敏度的人类嗜中性粒细胞α防御素单克隆以及多克隆抗体，对于组装一款灵敏度高、范围宽、操作简单便捷的人类嗜中性粒细胞α防御素多肽检测试剂盒具有重要意义。

本发明使用天然防御素偶联白蛋白来免疫，可得到比较优异的兔多抗和鼠单抗，并组装成试剂盒，灵敏度和精确度都有显著提高。

发明内容

鉴于现有技术所存在的检测成本高、检测范围窄，灵敏度低等问题，本发明提供一种人类α防御素多肽酶联免疫吸附试剂盒，所述检测试剂盒使用了优质的多克隆抗体和单克隆抗体，具有检测灵敏度高、检测范围宽、操作简单便捷等优点。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种人类α防御素多肽酶联免疫吸附试剂盒(全称为″人类嗜中性粒细胞α防御素多肽(HNP)酶联免疫吸附试剂盒”)，包括：酶标板、HNP蛋白冻干标准品、兔多克隆抗体、酶标二抗、标准品稀释液、25倍浓洗涤缓冲液、抗体稀释液、TMB显色液、终止液；

所述酶标板为鼠抗人HNP单克隆抗体包被的酶标板，所述鼠抗人HNP单克隆抗体的包被浓度1μg/mL；

所述HNP蛋白冻干标准品从病人痰液中提取并纯化冻干后获得，使用前稀释成不同浓度，10000pg/mL、4000pg/mL、1600pg/mL、640pg/mL、256、102、41pg/mL；所述稀释时间为使用前15min；

所述兔多克隆抗体为兔抗人HNP多克隆抗体(初始浓度为0.2mg/mL，使用浓度为0.2μg/mL)；

所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白多克隆抗体；

所述标准品稀释液为20g/L BSA、0.2g/L KH₂PO₄、0.2g/L KCl、2.9g/L Na₂HPO₄·12H₂O、8g/L NaCl水溶液；

所述样品稀释液为0.2g/L KH₂PO₄、0.2g/L KCl、2.9g/LNa₂HPO₄·12H₂O、8g/L NaCl水溶液；