[发明专利]猪细小病毒2型和3型双重实时荧光定量PCR检测引物

说明书

技术领域

本发明涉及猪细小病毒2型和3型（PPV2和PPV3）双重实时荧光定量PCR检测引物及方法，具体涉及用于PPV2和PPV3 多重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的引物及方法。

背景技术

随着病毒宏基因组学的研究的不断深入，新发病毒的发现的报道越来越多。近年来，猪群中DNA病毒的报道越来越多，除去经典的猪细小病毒（porcine parvovirus, PPV）和猪圆环病毒（porcine circovirus type ⅠandⅡ,PCV1和PCV2），还见有猪细小病毒2型（porcine parvovirus type 2，PPV2）、猪细小病毒3型（porcine parvovirus type 3，PPV3）、猪细小病毒4型（porcine parvovirus type 4，PPV4）以及多种亚型的猪博卡病毒（porcine bocavirus，PBoV）。【参考文献：Xiao CT, Giménez-Lirola LG, Jiang YH, Halbur PG, Opriessnig T. Characterization of a novel porcine parvovirus tentatively designated PPV5. PLoS One. 2013 Jun 7;8(6):e65312.】。

猪细小病毒2型(PPV2)最早于2001年在缅甸联邦共和国一例患有E型肝炎的猪只中检测到。此后在2006-2007我国（中国）患有高热病的猪群中检测到，之后再欧洲的匈牙利和美洲的美国均见有感染的报道。目前，关于PPV2的致病性的研究较小，致病机理还未见明确。【参考文献：Xiao C, Gerber P, Giménez-Lirola L, Halbur P, Opriessnig T. Characterization of porcine parvovirus type 2 (PPV2) which is highly prevalent in the USA. Vet Microbiol. 2013，161(3-4):325-30.】。

猪细小病毒3型(PPV3)是近年来在猪体内发现的新型DNA病毒，目前在德国、中国、罗马利亚、美国等国报道。【参考文献：Adlhoch C, Kaiser M, Ellerbrok H, Pauli G. High prevalence of porcine Hokovirus in German wild boar populations. Virol J. 2010，7:171.】。

SYBRⅠ实时荧光PCR是在普通PCR的基础上，在扩增反应体系中加入一对特异性引物，使用实时监测的荧光PCR检测仪来检测靶核苷酸序列的技术，具有特异性强、灵敏度高、定量准确、适用性广等优点。双重SYBRⅠ实时荧光PCR是在单重实时荧光定量PCR的基础上，利用2组引物扩增目的片段的GC含量差异导致Tm值差异，可在SYBRⅠ实时荧光PCR反应完成后结合熔解温度的差异来对猪细小病毒2型（PPV2）和3型（PPV3）进行快速鉴别诊断和感染程度分析。

目前，还没有基于SYBRⅠ双重实时荧光PCR检测猪细小病毒2型和3型（PPV2和PPV3）的相关研究报道，本发明的建立可填补相关领域空白。

发明内容

本发明的目的在于提供猪细小病毒2型和3型双重实时荧光定量PCR检测引物及方法，利用2组引物扩增目的片段的GC含量差异导致Tm值差异，可在SYBRⅠ实时荧光PCR反应完成后结合熔解温度的差异来对猪细小病毒2型和3型（PPV2和PPV3）进行快速鉴别诊断和感染程度分析。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

猪细小病毒2型和3型（PPV2和PPV3）双重实时荧光定量PCR检测引物，所述多重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测引物，其中，猪细小病毒2型引物序列如下：上游引物P1：GAAGCGGGGAAGATACTC，下游引物P2：GTCCTTAGCTCTCCACAG；猪细小病毒3型引物序列如下：上游引物P3：GAGGGAATTTAGCAACTG，下游引物P4：TCTGGTCTTCCTGATATC。