[发明专利]一种用于监测血管重构现象的方法与试剂盒

权利要求书

1.一种用于监测血管重构现象的方法，包括以下步骤：

A.体外培养的血管平滑肌细胞进行因素处理而制备成细胞爬片；

B.用清洗液清洗，加入固定液覆盖染色标本，置于-20℃固定10分钟；

C.用清洗液清洗，加入脱膜液覆盖染色标本，20-25℃孵育10分钟；

D.用清洗液清洗，加入封闭液覆盖染色标本，置于湿盒中孵育30分钟；

E.用含1％BSA的PBS缓冲液稀释细胞核增殖抗原Ki67，稀释浓度为1：200，将稀释好的液体覆盖染色标本，置于湿盒中4℃孵育过夜；

F.用清洗液清洗，加入Cy3标记荧光二抗，参考稀释浓度为1：200，置于湿盒内室温孵育2小时；

G.用清洗液清洗，加入预先配制的体积比为1：9的凋亡酶试剂和凋亡标记试剂，20-25℃保持1小时；

H.用稀释浓度为1：200的细胞核复染试剂进行复染，20-25℃染色10分钟，用清洗液清洗；

I.甘油封片，荧光显微镜观察。

2.一种用于监测血管重构现象的方法，包括以下步骤：

A.将血管组织制备成石蜡切片；

B.石蜡切片于60℃烤片2小时，依次置于二甲苯、100％乙醇、95％乙醇、75％乙醇、50％乙醇和去离子水中各3分钟；

C.用清洗液清洗，加入固定液覆盖染色标本，置于湿盒内孵育30分钟；

D.用清洗液清洗，加入封闭液覆盖染色标本，置于湿盒中孵育2小时；

E.使用含1％BSA的TBS缓冲液稀释细胞核增殖抗原Ki67，稀释浓度为1：200，将稀释好的液体覆盖染色标本，置于湿盒中4℃孵育过夜；

F.用清洗液清洗，加入Cy3标记荧光二抗，参考稀释浓度为1：200，置于湿盒内20-25℃孵育2小时；

G.用清洗液清洗，加入预先配制的体积比为1：9的凋亡酶试剂和凋亡标记试剂，20-25℃保持1小时；

H.用稀释浓度为1：200的细胞核复染试剂进行复染，20-25℃染色10分钟，用清洗液清洗；

I.甘油封片，荧光显微镜观察。

3.根据权利要求1或2所述的用于监测血管重构现象的方法，其特征在于：所述清洗液是PBS缓冲液。

4.根据权利要求1或2所述的用于监测血管重构现象的方法，其特征在于：在各步骤中用清洗液清洗时，至少清洗3次，每次清洗5分钟。

5.根据权利要求1或2所述的用于监测血管重构现象的方法，其特征在于：所述固定液是甲醇，在使用前置于-20℃预冷。

6.根据权利要求1所述的用于监测血管重构现象的方法，其特征在于：所述脱膜液是含有0.25％Triton X-100的PBS缓冲液。

7.根据权利要求1或2所述的用于监测血管重构现象的方法，其特征在于：所述封闭液是5％BSA。

8.根据权利要求1或2所述的用于监测血管重构现象的方法，其特征在于：所述凋亡酶试剂是末端脱氧核苷酸转移酶，所述凋亡标记试剂是核苷酸混合物。

9.根据权利要求1或2所述的用于监测血管重构现象的方法，其特征在于：所述细胞核复染试剂为DAPI。

10.一种用于监测血管重构现象的试剂盒，其特征在于，包括：

清洗液，为PBS缓冲液；

固定液，为甲醇；

脱膜液，为含有0.25％Triton X-100的PBS缓冲液；

封闭液，为5％BSA；

抗体：Ki67一抗，Cy3标记荧光二抗；

抗原：细胞核增殖抗原Ki67；

抗体稀释液：含1％BSA的PBS缓冲液；含1％BSA的TBS缓冲液；

凋亡酶试剂，为末端脱氧核苷酸转移酶；

凋亡标记试剂，为核苷酸混合物；

细胞核复染试剂，为DAPI。