[发明专利]一种转基因胰岛素的合成工艺在审
申请号: | 201410805967.7 | 申请日: | 2014-12-22 |
公开(公告)号: | CN104593399A | 公开(公告)日: | 2015-05-06 |
发明(设计)人: | 崔强军;张政;刘新亮;余炼 | 申请(专利权)人: | 广西大学 |
主分类号: | C12N15/70 | 分类号: | C12N15/70;C07K14/62 |
代理公司: | 广州三环专利代理有限公司 44202 | 代理人: | 郝传鑫 |
地址: | 530004 广西*** | 国省代码: | 广西;45 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 转基因 胰岛素 合成 工艺 | ||
1.一种转基因胰岛素的合成工艺,其特征在于,其工艺步骤如下:
(1)提取目的基因:向牛肉膏蛋白胨培养基中加入适量血清,接种培养人体胰岛B细胞,控制培养温度为35℃,PH为7.0,用限制性内切酶获取胰岛B细胞内的产胰岛素的核苷酸序列,提取目的基因,备用;
(2)培养工程菌:选用大肠杆菌作为工程菌,用肉汁培养基培养,接种与摇瓶培养基中,于35℃下振摇培养24h,调pH至5.0,而后放入恒温箱中培养,培养温度为35℃;
(3)提取质粒:35℃培养平板中挑取一个直径2~3mm的单菌落,接种到10ml LB培养液35℃剧烈振摇培养16h,取4ml菌液到5ml离心管,8000rpm室温离心3min,去上清,放于面巾纸上吸干痕液,加350ul RNaseA的溶液,将5ml离心管置于拇指和食指间柔和地反复颠倒数次,将上清倒入柱状收集管中,将柱状管放到一个消过毒的1.5ml离心管中,加65ul灭菌水,室温放置2min,8000rpm室温离心3min洗提质粒;
(4)基因重组:运用同种限制性内切酶切割步骤(3)提取的质粒的基因序列,再经过DNA聚合酶将步骤(1)提取的目的基因导入质粒基因中;
(5)感受态细胞的制备:将步骤(2)某一菌落置于-70℃温度下培养,而后用划线法接种细菌于培养皿,做好标记,于35℃培养过夜,第二天,从平板上挑取单个菌落,接种至含有3ml LB培养液的试管中,35℃振荡培养过夜,次日取菌液1ml接种至含有100ml LB培养基的500ml烧瓶中,350C剧烈震荡培养约2-3小时,当菌落600nm OD值达到0.4-0.5时,将烧瓶取出放置冰水上10-15分钟,在无菌条件下把菌液倒入50ml离心管中,4℃,8000g离心10分钟,弃上清,将管倒置于干滤纸上1min,吸干残留的培养液。加10ml 0.1M的CaCl2到离心管中,振荡混匀,悬浮菌体,冰浴30分钟,4℃,8000g离心10分钟,弃上清,将管倒置于干滤纸上1min,吸干残留的培养液,加2ml冰预冷的0.1M的CaCl2,重悬浮菌体,每管0.1ml分装,至4℃保存备用;
(6)导入载体:将步骤(4)载有重组基因的质粒导入步骤(5)制得的感受态细胞中,在大肠杆菌细胞施加高压,以使导入顺利进行;
(7)分离纯化:在牛肉膏蛋白胨培养基上培养步骤(6)得到的大肠杆菌,提取标记基因表达的菌落,将其接种到另一培养基中纯化培养;
(8)基因表达:经过分离纯化的工程菌置于发酵罐中培养,控制温度为35℃,从发酵罐流出液中即可提取,得到胰岛素。
2.根据权利要求1所述的转基因胰岛素的合成工艺,其特征在于,所述步骤(1)中,所述牛肉膏蛋白胨培养基中加入胰岛A细胞的分泌液。
3.根据权利要求1所述的转基因胰岛素的合成工艺,其特征在于,所述步骤(4)中,所述基因重组控制温度为35-40℃。
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