[发明专利]一种引物系统及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种引物系统及其应用，具体地，涉及一种用于扩增金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF(CFB)的引物系统，含有由该引物系统扩增产物的表达载体，含有该表达载体的转基因细胞，以及所述引物系统、所述表达载体、所述转基因细胞在体外抑菌和/或在制备用于抑菌的药物中的应用。

背景技术

近年来，由于抗生素滥用导致的微生物耐药问题变得愈发严重，新的耐药菌株及耐药事件不断见诸报道。过去的40年来，只有三种新型抗生素上市，且均用于治疗革兰氏阳性菌感染，因此开发新的抗生素替代物迫在眉睫。抗菌肽(AMPs)作为一种生物体内产生的抗菌小分子多肽，是一种广谱高效的，且不会产生耐药性的抗生素替代物质。金环蛇CBF于2008年首次被发现，其对于多重耐药铜绿假单孢杆菌、多重耐药肺炎克雷伯菌、耐药大肠杆菌和甲型副伤寒沙门氏菌的最小抑菌浓度(MIC值)分别为2.3μg/ml、0.3μg/ml、0.6μg/ml和1.2μg/ml，且在MIC浓度下2小时内可杀死全部细菌，其杀菌能力高于常用抗生素氨苄青霉素、盘尼西林以及大部分已报道的抗菌肽，例如人类LL-37。而且，CBF对于腐生真菌有很好的抑制作用，例如土曲霉、构巢曲霉和球毛壳菌，这是首次报道Cathelicidin家族AMPs抗腐生真菌的活性。在临床治疗方面，CBF也极具潜力。其可以通过增加细胞膜通透性、结合基因组DNA和阻止血管内皮生长因子VEGF的转录和翻译来抑制小鼠黑色素瘤细胞B16F10增殖，IC50值为7.3μM。而且，CBF对哺乳动物血细胞毒性极低，在浓度小于400μg/ml时，CBF对人类血细胞和小鼠巨噬细胞基本没有毒性。

由于大多数生物体内自然存在的AMPs量很少，这种方法得到的AMPs量也非常少，而且会导致浪费大量活体材料，对环境不利且成本极高，因此，目前用于研究的CBF均为化学合成，虽然这种方法可以获得一部分AMPs作为研究用途，但成本较高，尤其是分子量较大时。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述缺陷，提供了一种能够快速、低成本且大量地获得CBF的方法。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种引物系统，其中，该引物系统包括具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的引物1，具有SEQ ID No：2所示的核苷酸序列的引物2，具有SEQ ID No：3所示的核苷酸序列的引物3和具有SEQ ID No：4所示的核苷酸序列的引物4。

第二方面，本发明还提供了一种表达载体，其中，该表达载体含有由如上所述的引物系统经PCR扩增得到的产物。

优选地，用于构建所述表达载体的载体为pET-32a。

第三方面，本发明还提供了一种转基因细胞，其中，该转基因细胞含有如上所述的表达载体。

第四方面，本发明还提供了如上所述的引物系统、如上所述的表达载体、如上所述的转基因细胞在体外抑菌和/或在制备用于抑菌的药物中的应用。

通过上述技术方案，首次完成了CBF的异源体外表达，成功地实现快速、低成本且大量地获得CBF的目的，为CBF的大规模开发利用提供了理论基础。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是重叠PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中，M为分子量标记泳道，1为重叠PCR产物泳道。

图2是菌落PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中，M为分子量标记泳道，1-6为不同菌落的PCR产物泳道。

图3是诱导前(泳道1)和诱导后(泳道2)菌体表达CFB的SDS-PAGE图，其中，M为分子量标记泳道。

图4是CFB切割肠激酶后的抑菌结果。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

一方面，本发明提供了一种引物系统，其中，该引物系统包括具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的引物1，具有SEQ ID No：2所示的核苷酸序列的引物2，具有SEQ ID No：3所示的核苷酸序列的引物3和具有SEQ ID No：4所示的核苷酸序列的引物4。