[发明专利]一种从蛇毒中提取降纤酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体地说涉及一种从蛇毒中制备降纤酶精品的方法。

背景技术

长白山白眉蝮蛇乌苏里种蛇毒中的降纤酶是哺乳动物凝血及纤溶系统的蛋白酶。通过专一性的激活或灭活作用, 该蛋白酶作用于血液凝固、纤溶系统的各个步骤, 产生促凝或抗凝效应。在体外引起血浆纤维蛋白原的凝聚, 起凝血作用; 在体内它不激活凝血因子XIII。所以由它水解而生成的纤维蛋白凝块, 没有侧链交联, 容易被纤维蛋白溶酶降解、清除,造成体内纤维蛋白原浓度降低而表现为抗凝效应。在临床上蛇毒类凝血酶能用于防治血栓栓塞性疾病、急性脑梗死，以及脑梗死再复发的预防等。

降纤酶为白色非结晶粉末，有引湿性，易溶于水。有分解血浆纤维蛋白原、溶解血栓、降低血液粘度和血小板聚集力作用。用于急性缺血性脑血管病、不稳定性绞痛、高粘滞血症等血栓性疾病。

发明内容

本发明的目的是提供从蛇毒中提取降纤酶的方法。

本发明的技术方案是：将蛇毒干粉经亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤纯化和冷冻干燥得到降纤酶精品，包括如下步骤：

（1）蛇毒干粉用pH 7.0～9.0的含0.1～0.5mol/L NaCl、0.01～0.05 mol/L EDTA 的Tris-HCl缓冲液溶解，离心去沉淀，得上清液；

（2）亲和层析：用pH 7.0～9.0含0.1～0.5mol/L NaCl Tris-HCl平衡液平衡Argmatin- Sepharose柱，上清液上柱后，用pH 7.0～9.0含0.1～0.5mol/L NaCl、0.1～0.5mol/L盐酸胍的Tris-HCl缓冲液洗脱，洗脱液经超滤脱盐至无氯离子，加NaCl和1mol/L Tris-HCl稀释，至终浓度为pH 8.0～10.0含0.01～0.20mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液；

（3）离子交换层析：取上述缓冲液上样于DEAE-Sepharose Fast Flow柱后，用 pH 7.0～9.0含0.01～0.20mol/L NaCl 的Tris-HCl的平衡液冲洗至OD<0.1，换用pH 7.0～9.0含0.1～0.5mol/L NaCl的Tris-HCl洗脱液洗脱,紫外检测，收集酶活性部分，超滤浓缩；

（4）凝胶过滤层析：将上述浓缩液上样于Sepharcyl S-200凝胶柱，用pH 7.0～9.0含0.01～0.20mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液，紫外检测仪检测并记录，洗脱酶活性峰，超滤后冷冻干燥，即得成品。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。

实施例1

1）蛇毒干粉的溶解

取蛇毒干粉50g,溶于1500ml pH 8.5含0.2mol/L NaCl、0.02 mol/L EDTA 的Tris-HCl缓冲液中，于4℃冰箱中放置过夜，10000rpm离心8min,去除不溶物，得蛇毒上清液；

2）亲和层析

2.1）预先用6倍柱体积pH 8.5含0.2 mol/L NaCl的Tris-HCl平衡液平衡Argmatin-Sepharose CL-4B柱；

2.2) 将上述蛇毒上清液流经此柱，流速控制在3mL/min左右；

2.3) 平衡后，用pH 8.5含0.15mol/L NaCl、0.3mol/L盐酸胍的Tris-HCl缓冲液将酶活性部分洗脱；

2.4) 洗脱液经3KD超滤膜超滤，脱盐至无氯离子；

3）离子交换层析

3.1）将上述超滤脱盐后的溶液加NaCl和1mol/L Tris-HCl稀释，至终浓度为pH 7.5含0.10mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液；

3.2） 将上述稀释液上样于 DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用 pH7.5含0.10mol/L NaCl 的Tris-HCl的平衡液冲洗至OD<0.1；

3.3）换用pH 7.5含0.20 mol/L NaCl的Tris-HCl洗脱液洗脱,紫外检测，收集酶活性部分；

3.4）用超滤器（3KD膜）超滤浓缩至约100ml。

4）凝胶过滤层析

4.1）将上述浓缩液上样于 Sepharcyl S-200凝胶柱。

4.2）用pH 7.2含0.10mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液洗脱，流速为1ml/min。