[发明专利]水稻抗病基因OsSeh1及克隆方法、功能鉴定方法、应用

权利要求书

1.水稻抗病基因OsSeh1，其特征在于，其核糖核酸分子序列信息计算机可读版本是：

ATGGCGGAGCGGCAGGTGGCGGAGCTGGGGGCCGGCGCGGCGTGCGTAGGCTGGAACCACTGCGGCCGCCGCCTCGCCGCCGGCGCCGTCGACGGCTTCGTCTCCGTCTACGACTCCCAGTCCCAGCCGTCGCCTTCCTCCAAGTGGCAGGCCCACAAGCATGCGATCCTGAATATCGTGTGGCTTCCTCCGGACTATGGGGATGCTATAGCTTGTGTTTGTGCTGATGGGACGCTATCTTTGTGGGAGGAGGTCAGTGAAGATGATCAACTTCCAACCTGGAGGAAATGTAAAGTATTTGAGAGTGGCAATTCTCACATACTACACGTACAGTTTGGATTACAACTGTCTAGTCTAAAAATGGTTACTGCATACTCAGATGGCCAAGTGAAGGTTTATGAGCTCTTGGACTCGTTGGAATTAGACAAGTGGCAGCTTCAGGCGGAGTTCCAGAACATTACAGATCCTGTTTCCCGATCTGGGAAGCCAGCATGTACTTCTGCATCAATTGCATGGAGTCCAAGAAGAGGTGAAAGTCAGCAGGCTAGTTTTGCTATTGGTTTCAATTCAGACTCTCCAAATTTCAACTCTTGTAAGATTTGGGAGTTCGAAGAAGCTCACCAGCGTTGGCTCCCCCTTGTTGAGCTTGGCTCACCTCAGGATAAGGGGGATATAGTGCATGCTGTAGCATGGGCTCCTAACATCGGCAGACCATATGAGATCATAGCAGTTGCGACATGTAAAGGAATCGCAATCTGGCATATAGGCTTAAGCGCTGAATCTGACGGCAGCCTGTCAACTGAGAATGTGGCTGTACTTTCTGGCCATGATGGGGAGGTCCTGCAACTGGAATGGGACATGGGCGGTATGACACTCGCATCGACCGGAGGTGATGGCATGGTTAAGCTATGGCAGGCTAACCTGAATGGAGTTTGGCATGAACAAGCTGTGCTTGACTGCAATGTGTCTCACTAG。

2.权利要求1所述水稻抗病基因OsSeh1的克隆方法，其特点在于，按照以下步骤具体实施：

步骤一、材料的准备

水稻品种‘中花11’用于转化过表达及RNAi载体，并作为水杨酸处理的阴性对照；水稻品种‘日本晴’用于RNA提取；还准备大肠杆菌DH5α、农杆菌EH105、立枯丝核菌株；

步骤二、水稻基因OsSeh1的克隆

以拟南芥序列进行BLAST，搜索到‘日本晴’水稻基因组中与其同源性最高的基因序列(NP_001043597，Gene ID:4326622)，命名为OsSeh1，其CDS全长为972bp，编码323个氨基酸，用Primer 5.0设计一对特异性引物Seh-F(5′-TATGGTACCATGGCGGAGCGGCAGGTGGCGGA-3′)和Seh-R(5′-GCTCTAGACTAGTGAGACACATTGCAGTC-3′)，分别加上KpnI和XbaI两个酶切位点，用以扩增OsSeh1基因全长，同时设计另一对特异性引物mirF(5′-CGGATCCATGGTTACTGCATACTCAGATGG-3′)和mirR(5′-CGTCGACCTGAGGTGAGCCAAGCTCAA-3′)，分别加BamHI和SalI酶切位点，用以扩增RNA干涉片段；

取日本晴三叶期的水稻幼苗，Trizol试剂法提取总RNA，反转录成cDNA，作为PCR反应模板，扩增OsSeh1基因的PCR反应体系为：2.0mmol/L的MgCl₂、0.2mmol/L的dNTPs、0.25μg模板cDNA、1μmol/L上下游引物、1U Taq酶，反应体系总体积25μl，PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s、60℃复性30s、72℃延伸1min，进行32个循环；72℃总延伸10min，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测并纯化，进行TA克隆，载体为pEASY-T1。