[发明专利]一种谷物种子胚乳细胞的形态学分析方法

权利要求书

1.一种谷物种子胚乳细胞的形态学分析方法，包括以下步骤：(1)树脂切片的制作；(2)切片的染色；(3)图像的采集；(4)图像的前处理；(5)细胞的形态学分析，其特征在于，步骤(4)图像的前处理利用Photoshop软件的钢笔工具对种子细胞的轮廓进行精确的勾勒和描边。

2.根据权利要求1所述的形态学分析方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)树脂切片的制作

①取材和固定：采集谷物的种子，小心取出完整颖果，浸泡在4％多聚甲醛--2.5％戊二醛固定液中24h；

②漂洗和脱水：用0.1M磷酸缓冲液充分漂洗固定后的颖果，再用30％-50％-70％-90％-100％-100％乙醇对颖果逐级脱水，每级15min；

③树脂渗透、包埋和聚合：用25％-50％-75％-100％-100％伦敦白胶树脂对颖果逐级渗透，每级12h，再将渗透完的颖果放于包埋模具内，注入纯树脂，将包埋模具放在烘箱内，60℃聚合1-2天，使树脂硬化；

④修块和半薄切片：对包埋块进行手工修块，削去颖果周围多余树脂，用超薄切片机切厚度为2微米的切片，将切片转移到载玻片上的水滴上，将载玻片放在45℃加热板上干燥，使切片展平；

(2)切片的染色：用碘液、番红-甲基紫染液或荧光增白剂染液对展平的切片染色，通过对细胞内容物的染色反衬出细胞轮廓或直接对细胞壁进行染色显示细胞轮廓；

(3)图像的采集：在光学显微镜下拍摄切片上胚乳细胞的形态结构，保存图片；

(4)图像的前处理：用Photoshop软件打开拍摄的图片，利用钢笔工具对种子细胞的轮廓进行精确的勾勒，再用画笔工具对路径进行描边，保存图片；

(5)细胞的形态学分析：用Image-Pro Plus软件打开前处理的图片，利用“Count/Size”工具对胚乳细胞进行形态学分析。

3.根据权利要求1或2所述的形态学分析方法，其特征在于，步骤(3)中，图像的采集过程在光学显微镜下进行：

①当使用碘液或番红-甲基紫染液进行染色时，采用正常光模式进行拍摄；

②当使用荧光增白剂染液进行染色时，采用荧光模式进行拍摄。

4.根据权利要求1或2所述的形态学分析方法，其特征在于，步骤(4)中，所述图像的前处理具体操作如下：

①用Photoshop软件打开拍摄的图片，用“矩形选框工具”选出待分析的区域，点选菜单栏的“编辑”-“拷贝”，再点选“文件”-“新建”，弹出的对话框中将分辨率改为“300”，背景内容改为“背景色”，点击“确定”新建一个像素与待分析的区域相同的画布(背景为黑色)；

②点选菜单栏的“编辑”-“粘贴”，将待分析的区域复制到新画布上；

③选择“钢笔工具”，逐一对细胞壁进行精确勾勒，按“ESC”键完成勾勒；

④打开“路径面板”，双击“路径图标”，输入路径名称，点击“确定”保存路径；

⑤选择“画笔工具”，在“画笔工具栏”中将“大小”改为“4”像素，“硬度”改为“100％”；

⑥选择“钢笔工具”，右击画好的“路径”，在弹出菜单中选择“描边路径”，对话框中选择“画笔工具”，点击“确定”，待分析区域清晰地显示出胚乳细胞的轮廓；

⑦在“图层面板”中右击“背景图层”，在弹出菜单中选择“复制图层”，点击“确定”生成名称为“背景副本”的图层，拖动该图层至最顶端，右击“路径”，在弹出菜单中选择“描边路径”，对话框中选择“画笔工具”，点击“确定”，显示出背景为黑色，细胞轮廓为白色的图像；

⑧点选菜单栏的“文件”-“存储为”，保存为TIF格式的无损图片。