[发明专利]鸡γ干扰素表达基因改造方法、利用该方法改造得到的基因

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种鸡γ干扰素表达基因改造方法、利用该方法改造得到的基因。

背景技术

干扰素是一种低分子量的可溶性蛋白，目前一般将干扰素分为I、II、III型，其结构、受体和来源有所区别，活性侧重点也不同。干扰素功能主要有抗病毒、免疫调节和抗肿瘤。而II型干扰素(IFN-γ)其免疫调节能力是I型干扰素的数百倍，又因其是机体自身携带不会出现排异反应，所以是理论上十分理想的免疫佐剂。

ChIFN-γ可增加单核细胞和巨噬细胞表面IgG Fc受体表达，从而参与免疫复合物的清除、吞噬作用和抗体依赖细胞介导的细胞毒(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)作用。ChIFN-γ能使抗原呈递细胞表达MHC-II类抗原的数量显著增加、增强抗原呈递细胞与T细胞的相互作用，增加辅助T细胞(T-helper cell，Th)的数量和增强迟发型超敏反应(Delayed type hypersensity，DTH)；能增强细胞毒T细胞和自然杀伤(Natural killer，NK)细胞杀伤靶细胞的能力；能诱导细胞表达IL-2受体，从而促进T细胞增殖，进一步扩大免疫应答。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种鸡γ干扰素表达基因改造方法、利用该方法改造得到的基因，以解决现有技术中利用大肠杆菌表达鸡鸡γ干扰素产率较低的技术问题。

本发明解决的另一技术问题是通过对鸡γ干扰素表达基因的改进从而提升其所表达的鸡γ干扰素蛋白向胞外分泌的作用。

本发明解决的又一技术问题是通过对鸡γ干扰素表达基因的改进从而便于其所表达的鸡γ干扰素蛋白后期纯化。

本发明解决的再一技术问题是通过提供利用上述改造基因表达鸡γ干扰素的方法，以提升表达效率。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种鸡γ干扰素表达基因改造方法，该方法在鸡γ干扰素天然表达基因的基础上以大肠杆菌非稀有密码子替换其中的大肠杆菌稀有密码子。

优选的，所述鸡γ干扰素表达基因所表达的蛋白质N端对应的核苷酸上连接有信号肽或利用表达载体上的信号肽。

优选的，所述鸡γ干扰素表达基因末端具有标签蛋白；在此基础上进一步优选的：所述标签蛋白可以是His标签、Arg标签、FLAG标签或GST标签的其中一种。

本发明还提供了一种利用上述方法改造得到的鸡γ干扰素表达基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。

同时，本发明还提供了一种利用该基因表达鸡γ干扰素方法，包括以下步骤：将该基因插入表达载体中，而后将该重组表达载体导入大肠杆菌，以异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷为诱导物进行诱导表达，诱导浓度为0.1～1mmol/L，诱导温度为16～37℃，诱导表达时间为3～16小时。

优选的，所述表达载体是pBV220、pET系列载体或pQE系列载体的任一种；在此基础上更优的，所述表达载体是pET-28a(+)。

优选的，所述大肠杆菌是大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌JM109。

本发明提供的方法及基因专门针对原核表达系统，尤其是以大肠杆菌为宿主的表达系统，因此本发明的基因改造方法是在鸡γ干扰素天然表达基因的基础上将其中大肠杆菌的稀有密码子替换为非稀有密码子，从而提升了大肠杆菌对鸡γ干扰素及其衍生蛋白的表达效率。在此基础上，本发明通过对鸡γ干扰素表达基因密码子的取代、添加或缺失实现了改造后基因所表达的蛋白具有鸡γ干扰素的生物活性。此外，本发明通过在鸡γ干扰素表达基因上增加信号肽基因从而使得所表达蛋白N端连接有信号肽，进而促进蛋白分泌到细胞周质或培养基中。此外，本发明通过在鸡γ干扰素表达基因上增设标签蛋白基因从而使得所表达的蛋白N端或C端连接有标签蛋白，进而便于后期分离纯化。

本发明提供的序列如SEQ ID NO2所示的基因与鸡γ干扰素天然表达基因的核苷酸数量均为438个，所表达的蛋白其氨基酸数量相同，但二者序列存在一定程度的差异。本发明SEQ ID NO2所示基因表达的蛋白作为鸡γ干扰素蛋白衍生物具有鸡γ干扰素的活性且活性较天然鸡γ干扰素高，同时它以可溶蛋白的形式高效表达，表达后最高可占表达蛋白的50％以上，无需包涵体变复性等操作，通过一步纯化后纯度可达到95％；生产周期短，成本低；还具有很好的免疫调节活性和抗病毒活性，为该鸡γ干扰素的规模化生产奠定了良好的基础。

附图说明