[发明专利]一种测定花生籽仁内源激素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分析化学领域，尤其涉及一种测定花生籽仁內源激素的方法。

背景技术

植物激素是由植物自身代谢产生的一类有机物质，并自产生部位移作用部位，在极低浓度下就有明显的生理效应的微量物质，也被称为植物天然激素或植物内源激素。

植物激素与细胞分裂与伸长、组织与器官分化、开花与结实、成熟与衰老、休眠与萌发以及离体组织培养等方面息息相关，分别或相互协调地调控植物的生长、发育与分化。这种调节的灵活性和多样性，可通过使用外源激素或人工合成植物生长调节剂的浓度与配比变化，进而改变内源激素水平与平衡来实现。植物内源激素对植物体生长发育过程的调节，并不是单一激素作用的结果，而是多种激素之间相互作用的结果。因此，开展生理水平的多种内源激素检测及相关的前处理技术的研究是探索植物激素生理作用的基础工作。

植物内源激素的测定方法很多，根据其原理主要分为三类：生物鉴定法、免疫学方法和物理化学法。高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)分析植物内源激素以来，由于其具有灵敏度高和选择性、重复性好及分析速度快等特点，已在除乙烯外的四大类植物激素和 生长调节剂的研究领域中得到不断发展。植物内源激素对植物的各种生理活动起着重要的调节作用，因此，对其进行精确的定量检测成为学界关注的焦点之一。

现有技术利用高效液相色谱法测定籽粒中内源激素的含量，普遍是使用聚乙烯吡咯烷酮去除花生籽粒中的酚类，但是聚乙烯吡咯烷酮为水溶性的，对提取效果产生影响；在酸性条件下3-吲哚乙酸、脱落酸和赤霉素三种激素能被最大限度的提取，而细胞分裂素只有在碱性条件下才能被提取，现有技术将四种激素一起提取，大大减少了激素的提取量，导致最终检测结果不准确；现有技术采取等度脱洗，导致谱图出现峰图重叠、过度密集、拖尾等问题，内源激素得不到良好的分离；同时还存在操作复杂，成本高，一次只可处理一个样品，耗时，待测物在提取过程中的损失大等问题。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明提供一种测定花生籽仁內源激素的方法。通过该方法可以将内源激素最大限度的提取，在提取过程中内源激素的损失小，得到的高效液相色谱图目标峰无重叠、无拖尾。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种测定花生籽仁內源激素的方法，包括以下步骤：

(1)花生籽仁用液氮研磨成粉，称取1.0g置于离心管中，加入4-6mL体积分数为80％的预冷甲醇，摇匀，在0-4℃避光浸提12-24h，得到浸提样品；

(2)将步骤(1)得到的浸提样品在0-4℃以3000-4000r/min的转速离 心20min，收集第一上清液，得到残渣；

(3)将步骤(2)得到的残渣再次使用4-6mL体积分数为80％的预冷甲醇浸提，并在0℃冰水混合物中振荡2-4小时，然后在0-4℃以3500-4500r/min的转速离心15min，得到第二上清液，合并步骤(2)得到的第一上清液和所述第二上清液，得到上清液；

(4)将步骤(3)得到的上清液在30-38℃下旋转减压蒸发，去除上清液中的甲醇，得到浓缩液；

(5)将步骤(4)得到的浓缩液用等体积的三氯甲烷萃取三次，留取上层水相，然后向水相中加入交联聚乙烯吡咯烷酮振荡5-10min去除酚类，再以4500-5000r/min的转速离心5min，得到第三上清液；

(6)将步骤(5)得到的第三上清液用1mol/L的盐酸调节至酸性，用等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并上层酯相用氮吹仪吹干，得到残留物一；下层水相用0.5mol/L NaOH调节至碱性，用等体积的体积分数为80％的水饱和正丁醇萃取三次，合并上层酯相后用氮吹仪吹干，得到残留物二；

(7)将步骤(6)得到的残留物一和残留物分别用0.8-1.2ml甲醇水混合液溶解，甲醇与水的体积比为45:55，过微孔滤膜后用高效液相色谱仪进行分析，高效液相色谱采用梯度脱洗。

进一步，步骤(1)中所述甲醇中混合有27-32mg/L的二乙基二硫代氨基甲酸钠。

进一步，步骤(1)和(3)中所述预冷甲醇为将甲醇放置4℃环境中12-24h所得。

进一步，步骤(5)中所述交联聚乙烯吡咯烷酮的用量为1-3mg。

进一步，步骤(6)中所述酸性溶液pH值为2.5-2.8，所述碱性溶液pH值为8.0-8.5。

进一步，步骤(7)中所述水中混合有体积分数为0.4-0.5％的冰醋酸。