[发明专利]一种中东呼吸综合征冠状病毒中和抗体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种中东呼吸综合征冠状病毒中和抗体及其制备方法，属于细胞免疫技术领域。

背景技术

中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East Respiratory Syndrome Cononaviruse,MERS-CoV)与SARS-CoV同属冠状病毒科，beta冠状病毒属。为正链、单链RNA病毒。它表面刺突蛋白—S蛋白在病毒感染人和动物时起着关键作用。曾有科学家推测此病毒可能有来源于蝙蝠。序列分析发现，MERS-CoV病毒与蝙蝠和猪冠状病毒序列同源性非常高，与蝙蝠冠状病毒HKU4和HKU5可高达60％。目前仍然没有确定MERS-CoV病毒的来源和天然宿主，无法采取有效的措施来预防和阻止此病毒传播。

由于临床病症中MERS-CoV和SARS-CoV之间的相似性，提出它们可能会使用相同的细胞受体—血管紧张素转换酶2(ACE2)。然而，进一步研究发现：二肽基肽酶-4(DPP4，也被称为CD26)是MERS-CoV的受体，在人支气管和肾上皮细胞表达。病毒感染人时，病毒S蛋白受体结合区(Receptor Binding Domain,RBD)会与这种蛋白结合，病毒以它们为“登陆点”，附着到呼吸道细胞上，随之进一步侵人体内。CD26蛋白的氨基酸序列是高度保守的，还存在于蝙蝠和其他许多动物体内，因此，MERS-CoV病毒可能利用这种蛋白质在多个物种之间持续传播，有较大的潜在威胁。目前，感染MERS-CoV病毒后尚无有效治疗药物，主要是对症治疗，也没有预防性疫苗。单克隆抗体是针对特异抗原产生的特异抗体，它具有高度专一性，能精确地瞄准、捕获目标靶点，特异性地与靶目标发生反应，从而直接清除病毒的目的。

MERS-CoV病毒表面有一个膜蛋白称之为S蛋白，在病毒的复制和生命周期中发挥着重要作用。S蛋白上有部分区域，称之为受体结合区(Receptor Binding Domain,RBD)可以与细胞表面的CD26蛋白结合，介导病毒感染细胞。因而，寻找和制备有效的抗体阻止MERS RBD蛋白结合CD26蛋白，进而抑制病毒侵染细胞，成为检测、预防和治疗MERS-CoV病毒感染的方法之一。通过制备抗MERS RBD蛋白单克隆抗体，筛选可与之特异性结合的中和抗体，在分子水平上分析抗体与之结合的关键位点，进一步对其人源化，已成为制备预防或治疗性抗体的有效手段。目前还没有关于抗MERS-CoV病毒中和抗体的报道。

由于目前缺乏抗MERS-CoV病毒中和抗体，而且制备大量抗体及应用于临床需要较长时间，不能快速有效在临床上进行检测。

本发明描述了筛选具有中和活性的MERS-CoV鼠源单克隆抗体的技术，用于MERS-CoV的检测甚至预防和治疗。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)中和抗体，包含氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的重链可变结构域和氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的轻链可变结构域。

在本发明的一种实施方式中，所述MERS-CoV抗体是鼠源单克隆抗体2E6，其重链、轻链的氨基酸序列分别如SEQ IDMO.3、SEQ ID NO.4所示。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种制备MERS-CoV鼠源单克隆中和抗体的方法，首先是制备MERS-CoV病毒受体结合区蛋白(MERS RBD)，然后以该蛋白为抗原筛选到抗MERS-CoV病毒的鼠源单克隆中和抗体。

在本发明的一种实施方式中，所述方法主要包括以下步骤：

(1)以pFastBac1为表达载体，构建含有编码MERS RBD的基因的重组质粒pFastBac-MERS RBD转化DH10Bac感受态细胞、筛选鉴定阳性克隆，提取重组杆状病毒质粒，转染sf9细胞，培养获得高滴度病毒；然后感染Hi5细胞，从细胞培养上清液中纯化浓缩得到目的蛋白MERS-RBD。

(2)以MERS-RBD蛋白作为抗原免疫Balb/c小鼠，取血清抗体效价最高的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按5：1比进行融合，通过HAT筛选培养基和有限稀释法获得杂交瘤细胞；并进一步用ELISA检测筛选获得高效分泌MERS-RBD蛋白抗体的单克隆细胞株，注入小鼠腹腔制备腹水单抗，纯化获得鼠源抗体。