[发明专利]一种一步法诱导烟草单倍体植株的方法

说明书

技术领域

本发明属于烟草育种和植物组培技术领域，具体涉及一种一步法诱导烟草单倍体植株的方法。

背景技术

花药培养是诱导植物产生单倍体植株的育种手段之一，一直受到遗传育种界的重视。该方法起源于 20 世纪 60 年代，是指将未成熟的花药接种在人工培养基上进行培养、经过诱导分化形成为单倍体植株的过程。通过花药培养技术可以获得单倍体植株，单倍体植株的隐性性状能在早代就表现出来，因此可以及早对基因进行筛选和淘汰，通过对单倍体进行染色体加倍，可以获得性状十分稳定的纯合的二倍体，与常规的杂交育种相比，能够扩大变异范围、加速优异性状的转移与稳定、快速获得基因纯合的种质、提高育种工作的选择效率、明显缩短育种年限。花药培养技术已经在禾本科、茄科、十字花科作物以及许多药用植物的育种中得到了广泛的应用。目前，已经有三百余种植物花药培养获得成功，包括小麦、大麦、玉米、水稻、高粱、大豆、烟草、油菜、辣椒、黄瓜、苹果、葡萄、人参、地黄、枸杞等。早在 1974 年，我国科学家就利用单倍体技术培育出了世界上第一个单倍体作物新品种——烟草单育1号。

随着科学技术的发展，育种技术也不断推陈出新，诱变技术、原生质体融合技术、转基因技术、分子标记辅助选择、种质抗病性的快速鉴定、重要基因的克隆与验证等多项技术都已经广泛用于种质资源创新、杂交优势利用、品种选育等工作中。而近三十年，花药培养技术却未能在烟草育种中得到广泛的应用。究其原因，可能与花药培养过程操作复杂、对研究人员的无菌操作技术要求较高有一定关系。为了便于充分发挥花药培养技术的优势，将其广泛运用于作物遗传分析、功能基因分析等育种实践中，有必要简化花药培养创制单倍体、双单倍体群体等特殊种质的方法体系过程，以便花药培养技术能够和其他各项技术相结合，广泛应用于育种实践中。

发明内容

本发明目的在于提供一种一步法诱导烟草单倍体植株的方法，相较于现有的花药培养技术，能够简化花药培养技术操作的复杂程度，较为快速的培养出烟草单倍体植株，较好的应用到烟草的育种实践中。

本发明所采取的技术方案如下。

一种一步法诱导烟草单倍体植株的方法，包括以下步骤：

（1）从烟草花序上选取无病虫、生长良好、花冠刚刚伸出花萼的花蕾，花萼长度不超过1cm，将取好的花蕾迅速封装、编号，低温预处理，备用；一般而言，为获得合适的烟草花序，需要提前3~4个月时间播种所需的烟草品种；

所述低温处理是指将花蕾置于0℃~4℃条件下低温预处理2~3天；优选4℃低温预处理2天；

本发明中具体以烟草品种NC1071、中烟100与云烟87的杂交F1的两个烟草材料进行了实验；

（2）将步骤（1）中低温预处理后花蕾，在超净工作台内消毒灭菌，获得无菌花药，具体顺序为，向花蕾表面喷洒体积分数为70~75%的酒精消毒→纵切剖开花蕾，剥取花药→花药浸入体积分数为70~75%的酒精消毒50~70s（优选60s）→无菌水冲洗消毒后花药3次以上，每次3~5min；

（3）将步骤（2）中消毒后花药接种于改良MS培养基上25~27℃培养，培养分为暗培养和光培养两个过程，接种后首先于无光条件下暗培养10~14 d，然后转到弱光条件下培养至烟草小植株，所述弱光条件具体为每天光照8~10h，光照强度50~100 lx；

所述改良MS培养基为含有40g/L蔗糖的MS基本培养基。

本发明相较于现有的较为复杂的烟草花药单倍体培养技术而言，具有较为明显的技术优势，具体表现在：（1）消毒步骤简单，操作简便且安全性高；现有技术中的针对花蕾、花药消毒时所使用的药剂主要是次氯酸钠（NaClO）或升汞（HgCl2），而这两种药剂不仅对人体具有较大的毒性和伤害性，而且对于花药的损失也较大，严重影响了后续的组培效果，本发明通过改进采用普通的酒精消毒药剂，不仅无菌效果得到了较好的保障，而且对人无毒无害，对与花药也具有较小的损伤，确保了较好的组培效果；（2）花药的成活率较高；本发明通过将采摘后的花药进行低温预处理，较好的提高了后期组培时的花药成活率，并且能够较好的调整花药培养的操作时间，因而具有较好的推广应用性；（3）培养基制备简单易操作；在MS基本培养基中调整蔗糖浓度即可，因而易于制备。