[发明专利]缓释组分培养免疫细胞方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种缓释组分培养免疫细胞方法。

背景技术：

经典的CIK细胞培养方法需要通过多种细胞因子的共同培养诱导，如白细胞介素2、干扰素、抗CD3单克隆抗体等，传统方法是将这些细胞因子直接加入细胞培养基中，但是细胞因子在培养基中浓度减少较快，需要每天添加细胞因子，工作效率低，且影响细胞增殖速率。

发明内容：

本发明的目的是提供一种缓释组分培养免疫细胞方法。

上述的目的通过以下的技术方案实现：

一种缓释组分培养免疫细胞方法，将采集分离得到的外周血单个核细胞与含15％胎牛血清的DMEM一起置于包被有重组人纤维连接片断的培养瓶中，培养至第2日，加入各细胞因子微球1000μg/ml、抗CD3单克隆抗体2μg/ml、白细胞介素2 1000μg/ml；放入 37℃、5％CO₂培养箱中培养，且培养过程中调整细胞密度为0.5×10⁶-1.5×10⁶/ml。之后每3天更换培养基，每7天添加细胞因子微球至培养至第14天，细胞成熟。

培养时大约每毫升培养基中含7μl PLGA微球制备液（每微升制备液中含有1000个微球）。PLGA微球10-50μm，包含0.5% 细胞因子(活性剂), 3% Mg(OH)₂ (PH稳定剂), 肝素(生长因子稳定剂)：细胞因子重量比=1:1, 1 mM EDTA。

有益效果：

1. 本发明应用乳化溶剂蒸发法制作PLGA（聚乳酸-羟基乙酸共聚物）微球，含有PLGA及PVA（聚乙烯醇），PVA为稳定剂或乳化剂。根据微球大小不同PVA含量不同，释放曲线不同。PLGA微球尺寸10-40μm,平均直径为20μm，尺寸可由搅拌速度不同控制。

本发明将细胞因子（白细胞介素2、干扰素、抗CD3单克隆抗体）加入微囊或微球中，应用其缓释特性使生长因子在培养基中能够持续平稳、释放，节省成本、提高工作效率、使免疫细胞平稳扩增。

本发明缓释组分可使用多种，如：微球（PLGA微球）、无水聚乙烯醇（PVA）、纳米泵、藻酸盐凝胶、生物可降解水凝胶、脂质体、络合剂、持续释放微泵、纳米微粒、其它生物相容性材料。

附图说明：

附图1是本发明为在培养基中添加含细胞因子的常规培养基后，IL-2浓度在培养基中随时间的变化百分比。

附图2是本发明比较在培养基中直接加入IL-2细胞因子及加入IL-2微球后，IL-2浓度在培养基中随时间变化的百分比。

附图3是本发明比较在培养基中直接加入细胞因子及加入IL-2、IFN-γ、CD3 McAb微球后，CIK细胞集落形成情况。

具体实施方式：

实施例1：

一种缓释组分培养免疫细胞方法，将采集分离得到的外周血单个核细胞与含15％胎牛血清的DMEM一起置于包被有重组人纤维连接片断的培养瓶中，培养至第2日，加入各细胞因子微球1000μg/ml、抗CD3单克隆抗体2μg/ml、白细胞介素2 1000μg/ml；放入 37℃、5％CO2 培养箱中培养，且培养过程中调整细胞密度为0.5×10⁶-1.5×10⁶/ml。之后每3天更换培养基，每7天添加细胞因子微球至培养至第14天，细胞成熟。

实施例2：

本发明应用乳化溶剂蒸发法制作PLGA（聚乳酸-羟基乙酸共聚物）微球，含有PLGA及PVA（聚乙烯醇），PVA为稳定剂或乳化剂。

根据微球大小不同PVA含量不同，释放曲线不同。PLGA微球尺寸10-40μm,平均直径为20μm，尺寸可由搅拌速度不同控制。培养时大约每毫升培养基中含7μl PLGA微球制备液（每微升制备液中含有1000个微球）。PLGA微球10-50μm，包含0.5% 细胞因子(活性剂), 3% Mg(OH)2 (PH稳定剂), 肝素(生长因子稳定剂)：细胞因子重量比=1:1, 1 mM EDTA。