[发明专利]醇脱氢酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种醇脱氢酶突变体及其应用。该脱氢酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO：9所示氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，发生突变的氨基酸序列具有如下至少1个突变位点：第40位、第87位、第194位和第331位，且第40位的T突变为S、A或C；第87位的W突变为F、Y或H；第194位的V突变为I、L或E；第331位的R突变为A、K或M；或者，醇脱氢酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。具有上述至少一个突变位点或者保留上述突变位点且与其具有90％以上氨基酸序列同源性的醇脱氢酶突变体，其立体选择性和酶活性大大提高。

技术领域

本发明涉及酶及酶工程领域，具体而言，涉及一种醇脱氢酶突变体及其应用。

背景技术

酶作为生物催化剂，在生物体内能充分发挥其高效和高特异性的特点。但是在工业应用中，却普遍存在无法适应工业生产条件和对非天然底物的催化能力低等问题。必须借助蛋白质工程方法对酶分子进行改造以适应不同的应用要求。蛋白质工程方法可以概括为三种：理性设计(rational design)、非理性设计(irrational design)和半理性设计(semi-rational design)。

理性设计是指在了解蛋白质的空间结构的基础上，通过定点突变(Site-directedMutagenesis)或其它方法改变蛋白质分子中的个别氨基酸，从而产生新性状的蛋白质。这种方法在理论上针对性较强，主要用于改造天然酶蛋白的催化活性、底物特异性、稳定性、改变抑制剂类型、辅酶特异性等方面。

定点饱和突变技术是蛋白质工程中的一门重要技术，属于上述的半理性设计但又结合了理性设计和非理性设计的优点，弥补了各自的不足，它通过对目的蛋白的编码基因进行改造，短时间内获取靶位点氨基酸分别被其它19种氨基酸替代的突变体。此技术不仅是蛋白质定向改造的强有力工具，而且是蛋白质结构－功能关系研究的重要手段。研究表明，多点突变往往能获得比单点突变更为理想的进化体。多点突变是定点突变不易直接获得的。而对于定点突变技术不能解决的这些问题，恰恰是定点饱和突变技术所擅长的独特之处。

醇脱氢酶是一种氧化还原酶，在生物有机体的许多生物转化过程中发挥重要作用。基于其能催化产生高对应选择性的手性醇，醇脱氢酶通常作为一种非常重要的生物催化剂应用于化学和制药工业中手性中间体的合成。如一种新的用于艾滋病治疗的非肽类抗逆转病毒蛋白酶抑制剂地瑞那韦(Darunavir)。

目前已知的醇脱氢酶可以作为生物催化剂，一步还原酮类底物，制备得到近乎单一光学纯度的手性中间体(3R，3AS，6AR)-六氢呋喃并[2，3-B]呋喃-3-醇，简化了合成步骤，降低了生产污染。但是在工业生产的应用中，依然有一些问题需要进一步解决，如催化反应后产生的非对映异构体含量较高、酶催化活性较低等。

因此，仍需要对现有的醇脱氢酶进行改进，以提高其催化活性、底物特异性和/或稳定性，进而改善现有技术中如立体选择性较低、后处理过程繁琐、生产成本高等问题。

发明内容

本发明旨在提供一种醇脱氢酶突变体及其应用，以提高其催化活性和立体选择性。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种醇脱氢酶突变体，该醇脱氢酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO：9所示氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，发生突变的氨基酸序列具有如下至少1个突变位点：：第40位、第87位、第194位和第331位，且第40位的T突变为S、A或C；第87位的W突变为F、Y或H；第194位的V突变为I、L或E；第331位的R突变为A、K或M；或者，醇脱氢酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。