[发明专利]原肝干细胞和近肝干细胞

说明书

本申请是申请日为2003年3月14日、申请号为03809989.6、发明名称为“原肝干细胞和近肝干细胞”的申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及人类肝干细胞，产生成熟肝脏细胞的多能细胞。这些细胞包括两个干细胞群：真正的原祖细胞，即生成近肝干细胞的管板干细胞，以及生成肝细胞和胆管细胞的近干细胞。本发明也涉及分离人类肝管板干细胞以及分离近肝干细胞和定向肝细胞祖细胞和定向胆管祖细胞的方法；包括本发明的细胞的组合物可用于细胞和基因治疗以及用于建立生物人工器官。

背景技术

1.人类肝的解剖学

成熟肝的基本结构和功能单位是腺泡，其在横截面上的组织形式象围绕两个独特血管床的轮子：周边是3-7组肝门三联体(protal triad)(每组各具有门静脉、肝动脉和胆管)，而中心是中央静脉。肝细胞组织为细胞板结构，两侧均毗邻有孔内皮，形成一系列与肝门和中央脉管系统相邻近的窦状隙。最近的数据表明赫令氏管(Canals of Hering)，即一种位于肝门三联体周围的小管，在I带各处产生细小的小管，它们延伸并切入肝板，形成类似于瓶刷的模式(Theise,N.1999 Hepatology.30:1425-1433)。

称之为狄氏隙(space of Disse)的狭窄空间沿着窦状隙将内皮与肝细胞分隔开来。作为这种组织结构的结果是，肝细胞具有两个基部结构域(各自面对一个窦状隙)和一个顶部结构域(由毗邻肝细胞的接触区形成)。该基部结构域和血液接触并参与血浆成分的吸收和分泌，而顶部结构域则形成胆汁小管，专营胆汁盐的分泌，并且通过交联的网络与胆管相联。血管从门静脉和肝动脉流过窦状隙到达终末肝静脉和中央静脉。

根据这种微循环模式，将腺泡分成三个带：1带，门周区；2带，腺泡中区；以及3带，中心周围区。增殖潜能、形态标准、(染色体)倍性以及多数肝脏特异性基因与带状分布相互关联(Gebhardt,R等，1988.FEBS Lett.241:89-93；Gumucio,J.J.1989,Vol.19.Springer International,Madrid；Traber,P.等，1988.Gastroenterology.95:1130-43)。跨腺泡并且是沿着从肝门三联体到中央静脉血流方向上的血液成分(包括氧气)浓度的梯度，负责这种成带现象中一部分，例如糖酵解和糖异生的互逆区室化。然而，间隙衔接蛋白连接蛋白26的门周区成带现象以及谷氨酰胺合成酶的中心周围区成带现象等(此处仅举两例)，对此类梯度是不敏感的，而代表了多数组织特异性基因，并且似乎是由微环境中对细胞或者除血流以外的变量而言所固有的因子决定的。

除了肝细胞、胆管上皮细胞(胆管细胞)和内皮细胞外，肝门和中央胆管之间的区域还含有其它细胞类型，例如贮脂细胞(Ito cell)和枯否细胞(Kupffer cell)。这些细胞在肝脏病理状况下起着突出的 作用，尤其是在炎症和纤维症中，但它们对正常器官主要稳态功能的直接贡献明显要小。

2.人类肝的发育 

肝脏是由尾前肠和横隔(内脏间充质的一部分)形成的憩室汇聚发育的结果。肝细胞的形成很可能是通过成纤维细胞生长因子，起始于内胚层上皮细胞与生心中胚层相互作用之后。特化的肝细胞随之增殖并以索状方式穿入横隔的间充质，形成肝脏原基。上皮-间充质的直接相互作用在肝脏的这些早期发育阶段中是关键性的，并规定哪些细胞将分别成为肝细胞或胆管细胞以及有孔内皮细胞。间充质特异性基因hlx和jumonji的突变将阻断肝脏发育，从而阐释了该组织贡献的重要性。在其发育早期，肝脏由成簇的近肝干细胞组成，其由缺乏基膜的连续内皮细胞和丰富的造血细胞包围。在内皮细胞转化成为非连续的有孔内皮细胞时，维管结构尤其是肝门维管结构随着基膜的产生发育程度更高。肝门条间部可能为胆管发育提供引发机制，并且由于它环绕门静脉、肝动脉和胆管，而形成了肝门三联体。很可能是为了应答诸如C-CAM 105、Agp110、E-钙粘连蛋白和连接蛋白的组织形成分子在数量和分布上的变化，近肝干细胞迅速增殖并且形成实质肝板，同时伴有多数但并非所有造血细胞再定位于骨髓之中。最近的研究提示某些造血祖细胞存留于成年静息的啮齿类动物的肝脏中，并且已从成年人类和鼠的肝脏中都分离到造血干细胞(Crosbie,O.M.等1999.Hepatology.29:1193-8)。