[发明专利]一种从刀豆中提取尿素酶的方法

权利要求书

1.一种从刀豆中提取尿素酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1]提取

向刀豆粉中加入浓度为0.05-0.2M缓冲液常温搅拌提取0.5-2h，离心，收集上清液；

所述缓冲液内含质量浓度30％的丙酮、1mM EDTA和1mM巯基乙醇；所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、BTP缓冲液或Tris-HCl缓冲液；所述缓冲液的pH为6.8-7.5；所述缓冲液的投料量为刀豆粉末的3-10倍量；

2]沉降

向步骤1所得的上清液中加入酸性试剂，调节pH至5.8-6.2，冷藏，离心，然后收集上清液，继续用同一酸性试剂调节上清液pH至4.8-5.2，再冷藏，收集沉淀；

所述酸性试剂为盐酸、柠檬酸或醋酸；

3]中和

向步骤2所得沉淀中加入浓度为0.01-0.1M与步骤1相同的缓冲液中和，然后离心处理，继续加入同一缓冲溶液进行二次中和，离心，收集清液；

所述步骤3中缓冲液的pH为7.2-8.0；

4]微滤

将步骤3所得清液用陶瓷膜微滤，再加入清液0.2-0.4倍量的蒸馏水或浓度为0.01M与步骤1相同的缓冲液进行透析，收集透过液和透析液；

所述的陶瓷膜孔径为500-1200nm；

5]超滤

将步骤4所得的透过液和透析液用截留分子量在80-200KDa的有机膜进行超滤，同时用浓度为0.01-0.1M与步骤1相同的缓冲液进行等流量透析，收集浓缩液，然后冷冻干燥，既得尿素酶；

所述步骤5中缓冲液用量为透过液和透析液总质量的2-5倍；所述有机膜为PP膜、PES膜、PAN膜或PVDF复合膜。

2.根据权利要求1所述的从刀豆中提取尿素酶的方法，其特征在于：所述步骤1中，向刀豆粉末中加入8倍量的浓度为0.1M且pH为7.0的磷酸盐 缓冲液提取1h，离心，收集上清液；所述的磷酸盐缓冲液包含30％的丙酮、1mM EDTA和1mM巯基乙醇。

3.根据权利要求2所述的从刀豆中提取尿素酶的方法，其特征在于：所述步骤2中，向步骤1所得上清液中加入柠檬酸，调节pH至6.0，冷藏，离心，然后收集上清液，继续用柠檬酸调节上清液pH至5.0，再冷藏，收集沉淀。

4.根据权利要求3所述的从刀豆中提取尿素酶的方法，其特征在于：所述步骤3中，向步骤2所得沉淀中加入浓度为0.02M且pH7.5的磷酸盐缓冲液中和，然后离心处理，继续加入磷酸盐缓冲液中和，离心，收集清液。

5.根据权利要求4所述的从刀豆中提取尿素酶的方法，其特征在于：所述步骤4中，将步骤3所得清液用孔径为800nm的陶瓷膜微滤，再加入清液0.3倍量的蒸馏水进行透析，收集透过液和透析液。

6.根据权利要求5所述的从刀豆中提取尿素酶的方法，其特征在于：所述步骤5中，将步骤4所得透过液和透析液合并后用截留分子量100KDa的PES膜进行超滤，同时用浓度为0.02M pH 7.0的磷酸盐缓冲液进行等流量透析，收集浓缩液，然后冷冻干燥，既得尿素酶；所述缓冲液用量为透过液和透析液总质量的3倍。