[发明专利]一种绿色荧光蛋白标记蔓枯病菌的方法

权利要求书

1.一种绿色荧光蛋白标记蔓枯病菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)蔓枯病菌菌株分生孢子液的制备；

(2)制备含有GFP基因的农杆菌菌液；

(3)蔓枯病菌株的GFP基因转化标记；

(4)对标记有绿色荧光蛋白GFP的蔓枯病菌株进行鉴定；

(5)获得带有绿色荧光蛋白标记GFP的蔓枯病菌株。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蔓枯病菌菌株为蔓枯病菌菌株GSB20。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)的具体操作步骤为：使用打孔器切取蔓枯病菌GSB20菌块，在马铃薯固体培养基上培养4d后，在紫外光和普通光12小时交替培养10天，用培养液A冲洗培养基表面，收集并稀释孢子液，调节孢子液浓度至1x10⁶个/mL，得到蔓枯病菌株GSB20孢子悬浮液，备用。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)的具体操作步骤为：将携带表达绿色荧光蛋白载体pGFP的农杆菌AGL-1在新鲜的平板B上划线，28℃培养48h后，挑取单克隆，接种到5mL培养液B中，于25℃，220rpm振荡培养48h后用紫外分光光度计测OD₆₀₀值，用培养液A稀释，使菌液OD₆₀₀＝0.10，然后将菌液稀释液在28℃振荡培养4h，得到AGL-1农杆菌菌液，备用。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)蔓枯病菌株的GFP基因转化标记方法如下：

1)将步骤(2)中制备的AGL-1农杆菌菌液和步骤(1)中制备的蔓枯病菌株GSB20孢子悬浮液等体积混合，取200μL混合液均匀涂布于不含抗生素的IM共培养平板上的硝酸纤维素滤膜表面，24℃避光共培养24h；

2)共培养24h后，将滤膜揭下，正铺到培养基C上，24℃培养168h，生长出转化子；

3)用无菌接种环挑取单个转化子接种到PDA筛选平板上进行二次筛选，25℃培养，保存转化子GSB20-GFP，用于阳性鉴定。

6.根据权利要求3-5任一所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)、(2)中的培养液A为加入了400μmol·L^-1乙酰丁香酮的IM液体诱导培养基，IM液体诱导培养基；平板B是加入了50mg·L^-1卡那霉素和50mg·L^-1利福平的YEB平板；培养液B是加入了50mg·L^-1卡那霉素和50mg·L^-1利福平的MM液体基础培养基。

7.根据权利要求3-5任一所述的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中的培养基C是加入了300mg·L^-1特美汀和100mg·L^-1潮霉素的马铃薯固体培养基。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)的具体操作步骤为：

1)采用PCR方法，用真菌ITS通用引物、蔓枯病菌株特异性引物、绿色荧光蛋白基因的特异性引物检测阳性转化子为被标记绿色荧光蛋白基因的蔓枯病菌株；

2)采用OLYMPUS DP72荧光显微镜观察转化子是否携带绿色荧光蛋白基因。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)的具体操作步骤为：

1)采用PCR方法，用真菌ITS通用引物、蔓枯病菌株特异性引物、绿色荧光蛋白基因的特异性引物检测阳性转化子为被标记绿色荧光蛋白基因的蔓枯病菌株；

2)采用OLYMPUS DP72荧光显微镜观察转化子是否携带绿色荧光蛋白基因。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述的步骤(4)中的真菌ITS引物为：

ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，

ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’、

鉴定蔓枯病菌株特异性引物为：

DB17F：5’-GCAGTCAATCCTTATCC-3’，

DB17R：5’-CGAAAGATTGTGTGACC-3’，

绿色荧光蛋白基因的特异性引物为：

GFP-F：5’-ACGGCAAGCTGACCCTGAAG-3’，

GFP-R：5’-CTCGTCCATGCCGAGAGTGA-3’。