[发明专利]一种均相酶解纤维素的方法

说明书

本发明公开了一种均相酶解纤维素的方法，以分子量为20000单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺为修饰剂，定点修饰市售纤维素酶的巯基，制得修饰纤维素酶，标记为Cell‑Mal 20k；用合成的修饰酶Cell‑Mal 20k在氢氧化钠/尿素水溶液中均相酶解纤维素，反应温度30℃，反应时间1h,体系pH值13.98，反应结束后，冷却至‑10℃，Cell‑Mal 20k与产物相分层，分别回收Cell‑Mal 20k和产物相，Cell‑Mal 20k无需处理，可直接循环使用。本发明的特点在于所制备的修饰纤维素酶稳定性高且具有温敏性，在强碱性的氢氧化钠/尿素水溶液中仍能保持高的活性和温控性，实现了酶的高效回收和重复使用，为纤维素提供了一条高效酶解的新途径。

技术领域

本发明涉及一种在NaOH/尿素/纤维素均相体系下，聚乙二醇马来酰亚胺修饰纤维素酶均相酶解纤维素及其温控分离的方法。

背景技术

纤维素是全球再生量最大的生物质资源，每年生物合成量超过500亿吨。纤维素高值化利用的关键在于如何使其高效降解成单糖，进而可以转化成用途广泛的重要化学品或燃料。因此从长远考虑，实现纤维素高效转化成单糖是解决化石资源日益减少所带来的全球资源危机的有效途径之一。

目前纤维素降解方法包括物理法、化学法和生物法，其中生物法是指利用纤维素酶对纤维素中β-糖苷键进行特异性水解，从而制得糖类化合物的一种有效方法，具有对环境友好，能耗低，副产物少等优点，被认为是最具应用前景的转化途径。但是，由于纤维素是线性长链高分子聚合物，其分子中的羟基易和分子内或相邻分子上的含氧基团形成强氢键作用，使纤维素分子共同组成结晶结构，该结构使纤维素显示出刚性和高度水不溶性，大大减弱了纤维素酶对纤维素的可及性，导致纤维素的转化率低，酶解周期长，成本高。因此，需要寻找对纤维素有高效溶解能力的溶剂，以瓦解纤维素的这种高度结晶结构，有利于纤维素酶与纤维素的有效接触，促进其酶解。目前，对纤维素具有良好溶解能力的溶剂有N-甲基吗啉-N-氧化物(NMMO)、氯化锂/二甲基乙酰胺(LiCl/DMAc)体系、氨基甲酸酯体系和离子液体等，这些溶剂在不同程度上存在着价格高、溶解条件苛刻、易挥发、回收困难、所得溶液粘稠等问题，极大地限制了纤维素的应用。2005年武汉大学的张俐娜老师开发了新一类溶解纤维素的溶剂体系，NaOH/尿素、NaOH/硫脲、LiOH/尿素水溶液体系，其中NaOH/尿素体系以其廉 价和高效的溶解性能成为大家关注的热点。采用7wt％NaOH/12wt％尿素水溶液预冷至-12℃,它能迅速溶解纤维素(重均分子量Mw为1.2×105)得到透明的溶液(5min内完全溶解)。该纤维素溶液在0～5℃的范围内能够长时间保持稳定的溶液态(约1周)。这种新溶剂体系采用了最经济、最普通的化工原料，且所用的化学原料容易回收,可循环使用，因此该体系被认定是新一代无污染的绿色纤维素新溶剂。在该体系下,溶剂小分子更易与纤维素上的-OH基团结合形成新的氢键网络从而破坏纤维素原有的分子内和分子间氢键，使得纤维素在小分子溶剂的包合下，以链状形式均匀分布于水中，得到透明的纤维素溶液。若能在该体系下实现均相酶解，同时反应后将纤维素酶分离出来，进行循环利用，那么富含还原糖的NaOH/尿素体系就可通过pH的调节以适应后期发酵生产。可以设想，按照以上的研究思路，一个高效绿色的纤维素利用体系将被建立。

发明内容

本发明的目的是创制具有高效高稳温敏的纤维素酶，以实现在NaOH/尿素体系下纤维素的均相酶解及纤维素酶的有效回收。

本发明的技术方案是这样实现的：将7wt％NaOH/12wt％尿素水溶液预冷至-12℃，然后加入微晶纤维素，得到均相溶液，pH值为13.98，纤维素占溶剂的重量比5-10％。在30℃下加入修饰纤维素酶，加入量为每毫升溶剂0.5-5mg，反应1小时，纤维素转化成还原糖的转化率在70-80％。反应结束后，体系降温到-10℃，修饰酶主动从反应体系中析出，可直接回收利用。