[发明专利]一种新的基于LC-MS/MS的精氨酸测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于利用特定衍生化试剂，特别涉及一种精氨酸酸衍生化后，依赖LC-MS/MS测定血浆中精氨酸浓度的方法。

背景技术

精氨酸（L-Arg）是动物细胞内功能最多的氨基酸之一。它参与合成细胞浆蛋白和核蛋白过程，并在细胞分裂、蛋白质合成和激素分泌等各种生理过程中，都起着重要的作用。

精氨酸也是多胺合成的起始物。多胺是重要的生物学调控物质，与DNA、RNA及蛋白质的生物代谢有关，在细胞生长周期过程中起关键的调节作用；参与分裂素诱导的T细胞免疫反应，在调控中枢神经系统原发性免疫反应中起关键性作用；其作为生命活动的调节因子，在整个分子调控过程中不可或缺；其药理作用明确，在肝性脑病的治疗中，作用显著。

精氨酸的测定，目前有多种方法，主要是为以下两种方式：

（A）直接测定法： 基于离子交换色谱的氨基酸分析仪已成为直接分析法主流，采用高效阴离子交换色谱积分脉冲安培检测法（HPAEC–IPAD），戴安公司上世纪推出氨基酸AAA–Direct TM 系统就是此种方法代表。该方法可同时对一级和二级氨基酸进行检测，无需柱前、柱后衍生，直接进样分离效果好、灵敏度高、操作简单；但此类氨基酸分析仪专属性强，价格昂贵，大大限制其推广与应用。

（B)间接测定法：这里主要是依赖柱前衍生化和柱后衍生化的方法：柱后衍生化主要依赖如茚三酮、邻苯二甲醛。其优点是：反应重复性好，未被衍生的化合物若有光吸收时，也可同时进行分离和检测。其主要缺点是衍生化条件限制。由于衍生反应在特定反应器中进行，常造成色谱峰展宽，使分离度降低；过量试剂或试剂水解产物可能造成干扰，定量下限浓度高，不能检测纳克或以下级别的浓度。

柱前衍生化主要通过：荧光胺、异硫氰酸苯酯、氯甲酸芴甲酯、6-氨基哇琳基-N-琥珀酰-亚胺基甲酸酯6-氨基哇琳基-N-琥珀酰-亚胺基甲酸酯（AQC）、丹磺酰氯、邻苯二甲醛（OPA）、2，4-二硝基氟苯等衍生试剂（DNFB）。对于使用荧光胺，其具有一定选择性，能与一级氨基酸在pH为 9和室温条件下瞬时反应，荧光强度高；而试剂本身则迅速水解，不影响分析。但其缺点是，定量线性范围受到仪器限制，其定量上限与定量下限的范围在1~2个数量级，对于药代动力学分析来说，样品处理过程便需要做大量稀释，造成不便。

使用异硫氰酸苯酯，首先在5～10分钟内完成反应，并降低氨基酸的亲水性。便于常规分析柱的使用。但其结构过于短小，且微量的残留都会降低普通C18分析柱使用寿命，不便于大量样品的处理及分析。

氯甲酸芴甲酯、AQC和OPA均利用荧光检测，但反应条件苛刻，且同样有分析定量范围狭窄的问题，且当样品中存在羟基脯氨酸和羟基赖氨酸时，反应副产物会严重干扰定量，因此在血浆样品分析时，需要慎重考虑基质影响；丹磺酰氯衍生产物的干扰较大，且峰型很差，不利于精确定量；DNFB衍生试剂毒性较大；过量衍生试剂对分析有一定影响。

近年来，由于液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)新技术的不断出现，LC-MS/MS已成为现代分析手段中必不可少的组成部分。LC-MS/MS联用的优点非常显著，因为气相色谱只能分离易挥发且不分解的物质，而液相色谱则把分离范围大大拓宽了，生物大分子也能分离，LC与高选择性、高灵敏度的MS/MS结合，可对复杂样品进行实时分析，即使在LC难分离的情况下，只要通过MS1及MS2对目标化合物进行中性碎片扫描，则可发现并突出混和物中的目标化合物，显著提高信噪比。对于在此我们仅对电喷雾电离(ESI)技术做简单介绍。溶液样品流出毛细管喷口后，在雾化气(N2)和强电场(3～6kV)作用下，溶液迅速雾化并产生高电荷液滴。随着液滴的挥发，电场增强，离子向液滴表面移动并从表面挥发，产生单电荷或多电荷离子。通常小分子得[M+H]+ 或[M-H]-单电荷离子，生物大分子产生多电荷离子，由于质谱仪测量的是质荷比(m/z)，可测定的生物大分子的质量数高达几十万。ESI是很软的电离，可直接测定热不稳定的极性化合物，多电荷形成可分析蛋白质和DNA等生物大分子，调节离子源电压可以控制离子的断裂，给出结构信息。

利用LC-MS/MS技术分析精氨酸时，由于精氨酸的亲水性，ESI源内的响应低与分析方法建立时，所需要的高灵敏度的矛盾，需要一种新的具有显著提高响应度专属性的分析方法。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述背景技术的缺点，提供一种方便快捷的利用氨基酸衍生化方法，基于LC-MS/MS对精氨酸产物进行高灵敏度、高准确性的定量检测方法。