[发明专利]一种血清miRNA生物标志物组合物与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物标志物，尤其是涉及一种血清miRNA生物标志物组合物与应用。

背景技术

miRNA又称microRNA，是一类由大约22个核苷酸组成的单链非编码RNA，主要利用信使RNA的直接剪切或间接抑制翻译在转录后水平调控靶基因的表达。miRNA在个体发育的不同时期如细胞分化、增殖、凋亡等及不同组织中有不同的表达模式，表明其在发育和分化中起着重要的调控作用。通过对组织miRNA表达谱的研究已经发现，miRNA具有很强的细胞、组织或疾病特异性，这些特异表达的miNRA既是其功能研究的基础，又是很好的疾病标记物。近年的研究显示，miRNA不但与疾病的发生和发展有关，还能够游离于细胞之外，稳定存在于血浆或血清中，具备疾病分子生物标记物的某些特点，目前已经在多种肿瘤和非肿瘤疾病的诊断和预后中显示了独特的价值(Chen X,Ba Y,Ma L,et al.Characterization of microRNAs in serum:a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases[J].Cell research,2008,18(10):997-1006.)。

传统的miRNA检测技术如northern杂交，microarray杂交，对低丰度的miRNA的扩增敏感性差。荧光定量PCR(qRT-PCR)是检测基因表达量最灵敏、可靠的方法，但常规的qRT-PCR技术难以检测约22bp的miRNAs，为克服这个问题，Life Sciences公司等开发了Taqman检测法，但是该方法成本较高，也无法通过溶剂曲线分析PCR发应的特异性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种血清miRNA生物标志物组合物。

本发明的第二目的是提供血清miRNA生物标志物组合物在制备少精症和无精症检测试剂中应用。

本发明的第三目的是提供一种用于少精症和无精症检测的试剂盒。

所述血清miRNA生物标志物组合物包括miRNA中的至少一种以及各miRNA的反转录引物、正向引物和反向引物的序列；

所述miRNA包括：

miR-34c：aggcaguguaguuagcugauugc；

miR-1275：gugggggagaggcuguc；

miR-375：uuuguucguucggcucgcguga；

miR-410：agguugucugugaugaguucg；

miR-758：gaugguugaccagagagcacac；

各miRNA的反转录引物、正向引物和反向引物的序列如下表所示：

所述血清miRNA生物标志物组合物可在制备少精症和无精症检测试剂中应用。

所述用于少精症和无精症检测的试剂盒包括所述血清miRNA生物标志物组合物以及Taq酶、dNTP、MgCl2和PCR缓冲液。

所述少精症和无精症检测试剂的使用方法如下：

1)建立统一标准的标本库和数据库：从医院采集血样样本，同时系统收集患者的病理学资料和临床资料；

2)血清miRNA差异表达谱分析：选择健康个体和少精症、无精症患者的血清，提取总RNA，并采用Agilient miRNA芯片筛选技术，对样本的总RNA特异的检测Sanger microRNA数据库(miRBase，19.0版本)的1888个人类相关miRNA，并且能特异性地检测出成熟的miRNA并能很好地区分高度同源的miRNA分子；

3)用实时荧光定量PCR方法(茎环法)筛选出可用作检测分子标志物的血清miRNA：对已筛选的血清差异表达的miRNAs在大样本人群中进行定量分析验证，确定能够用于区分正常人和少精症或无精症的miRNA：miR-34c(SEQ ID NO.1)，miR-1275(SEQ ID NO.2)，miR-375(SEQ ID NO.3)，miR-410(SEQ ID NO.4)和miR-758(SEQ ID NO.5)。

本发明使用的检测方法可以选自：RT-PCR方法、芯片技术、测序技术、荧光定量PCR方法等中的至少一种。

本发明所述血清miRNA生物标志物组合物、检测方法为少精症和无精症的病理研究提供数据支持，具有以下有益效果：