[发明专利]检测常见致病真菌的荧光定量PCR引物、探针及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及实时荧光PCR检测试剂盒，特别是涉及使用实时荧光定量PCR技术快速鉴定临床样本常见致病真菌的试剂盒及检测方法。

背景技术

近年来，随着抗生素、免疫抑制剂及皮质类固醇激素在临床上广泛应用，器官移植、导管插管等普遍开展，深部真菌感染率越来越高。深部真菌感染是一种重症感染，死亡率为40-90％，真菌病的发病率近年来呈上升趋势，尤其对重症监护病房和免疫缺陷患者、以及癌症患者，8％的院内感染由真菌引起。

据统计，近30年深部真菌感染的发病增加了3-5倍，真菌感染已成为艾滋病的重要死亡原因之一。引起深部真菌感染的病原菌主要有念珠菌、曲霉菌和隐球菌等。其中念珠菌属感染最多，其次为曲霉菌感染，且侵袭性曲霉菌感染率正逐年升高，病死率较高，而各种抗真菌药物的滥用，更加剧了真菌感染的复发和增加了治疗难度，其感染患者的存活主要依赖于早期诊断和早期治疗。传统的实验室诊断方法耗时太长，耽误时间的同时恐错过最佳治疗时机，同时敏感性较低，因此从技术上解决这一问题颇为重要。

目前，临床上常用的深部真菌诊断方法有：传统培养法、影像学检查法、血清学检查。以上方法均存在一定的缺陷：传统培养法是诊断真菌感染的最直接方法，准确度高，但其耗时长、易污染、敏感性低的缺点使其不利于临床患者诊断；影像学检查通过高分辨率的机器对患者病灶部位直接进行动态观察，具有重要的提示价值，但此方法不仅特异度低且仅对高危病人具有早期诊断价值；血清学方法具有一定的敏感度和特异性，但诊断的假阳性率较高。

目前相对最为先进、也最有发展前景的是分子生物学方法，即PCR，聚合酶链式反应方法。传统的PCR技术虽具有较高的灵敏度，但特异度低，因外源污染等问题容易造成假阳性结果。实时荧光定量PCR技术能够在极短的时间内检测出组织中极微量的真菌DNA，具有较高的灵敏度和特异性。

临床常见的侵袭性真菌主要有念珠菌、曲霉菌和隐球菌等，目前尚未发现使用探针法荧光PCR可以检测不同真菌菌属的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种检测常见致病真菌的荧光定量PCR引物、探针及试剂盒，本发明独立设计特异性的引物与TaqMan探针，建立一种荧光PCR检测方法能够同时检测15种临床常见致病真菌，其中包括8种假丝酵母菌(白色念珠菌、光滑假丝酵母、近平滑假丝酵母、乳酒假丝酵母、清酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、季也蒙假丝酵母、热带假丝酵母)，4种曲霉菌(黑曲霉、黄曲霉、土曲霉、烟曲霉)以及隐球菌、米根霉和卷枝毛霉，该方法具有较高的灵敏度和特异性，对于侵袭性真菌感染的早期诊断和治疗具有重大意义。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种检测常见致病真菌的荧光定量PCR引物，引物序列如下：

引物F1序列：5`-ACTTTYAACAAYGGATCTCTTGGYTC-3`

引物F2序列：5`-TGACRCTSRRACAGGCATG-3`

引物F3序列：5`-TGATACTGAARCAGGCGTRCTC-3`。

而且，所述常见致病真菌包括8种假丝酵母菌：白色念珠菌、光滑假丝酵母、近平滑假丝酵母、乳酒假丝酵母、清酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、季也蒙假丝酵母和热带假丝酵母，4种曲霉菌：黑曲霉、黄曲霉、土曲霉和烟曲霉，以及隐球菌、米根霉和卷枝毛霉。

一种检测常见致病真菌的荧光定量PCR探针，序列如下：

荧光探针F1序列：5`-FAM-CATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGC-TAMRA-3`

荧光探针F2序列：5`-FAM-CATCGATGAAGAACGYAGCRAARTGC-TAMRA-3`。

一种检测常见致病真菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：包括上述的引物和探针。

而且，还包括内参照质控，其引物和特异性检测探针序列如下：

引物N1序列：5`-CAAGTCGAACGGTAACAGGAAGAA-3’

引物N2序列：5`-TCTTGCGACGTTATGCGGTAT-3’

荧光探针N序列：5’-VIC-CTTGCTTCTTTGCTGACGAG-TAMRA-3’。

而且，所述常见致病真菌包括8种假丝酵母菌：白色念珠菌、光滑假丝酵母、近平滑假丝酵母、乳酒假丝酵母、清酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、季也蒙假丝酵母和热带假丝酵母，4种曲霉菌：黑曲霉、黄曲霉、土曲霉和烟曲霉，以及隐球菌、米根霉和卷枝毛霉。