[发明专利]产酶溶杆菌OH11中一种抗真菌和卵菌活性代谢产物及其分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及来源于产酶溶杆菌OH11的一种抗真菌和卵菌活性代谢产物及其分离方法。

背景技术

溶杆菌(Lysobacter spp.)属于黄单胞科(Xanthomonadaceae)、溶杆菌属(Lysobacter)。1978年，溶杆菌属正式建立。近年来，通过系统发育分类学方法完善了溶杆菌属的分类地位，截止2014年7月，国际上已鉴定的溶杆菌属细菌有32个种。该属细菌无鞭毛但有滑移性，对许多微生物，如真菌、卵菌、酵母、细菌、单细胞藻类和线虫都有较好的拮抗活性，是一类具有重要生防和药用潜力的革兰氏阴性菌。其作用机理为：(1)产生小分子抗菌次生代谢产物；(2)分泌产生大量胞外酶，包括几丁质酶、β-1,3-葡聚糖、蛋白酶和纤维素酶；(3)诱导植物产生抗病性；(4)较好的定殖能力。

产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)OH11是本实验室自主分离的一个菌株。室内抑菌试验表明，该菌对多种植物病原真菌、卵菌和细菌均有较强的拮抗活性；温室防病试验表明，该菌对植物真菌、卵菌和细菌病害的总体防治效果为50％－70％(见专利ZL200710190998.6)。进一步研究表明：OH11能产生多种抗菌小分子代谢产物和胞外酶，而且这些小分子代谢产物是其具有抗菌活性的主要原因，因此，分离鉴定对真菌和卵菌具有拮抗作用的小分子化合物对于阐明溶杆菌作用机制，开发新型杀菌剂或农药先导化合物具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题提供产酶溶杆菌OH11中一种抗真菌和卵菌活性代谢产物及其衍生物。

本发明还有一个目的是提供产酶溶杆菌OH11的一种抗真菌和卵菌活性代谢产物的制备方法及其应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种从产酶溶杆菌OH11发酵液中分离的抗真菌和卵菌活性代谢产物，该产物的结构式如式Ⅰ：

一种从产酶溶杆菌OH11发酵液中分离的抗真菌和卵菌活性代谢产物的衍生物，该衍生物的结构式如式Ⅱ：

其中，R₁为H、OH、F、Cl、Br、I或OR₃；

R₂为H、OH、F、Cl、Br、I或OR₄；

R₃，R₄彼此独立地为R₅CO-；

R₅为H或C1-C4的烷基。

优选：R₁为H、OH、Cl、Br、I或OR₃；R₂为H、OH、Cl、Br、I或OR₄；R₅为H

所述的产酶溶杆菌OH11发酵液中提取的抗真菌和卵菌活性代谢产物，该产物的结构式

如式Ⅱ-a～s：

一种从产酶溶杆菌OH11发酵液中分离的抗真菌和卵菌活性代谢产物的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将产酶溶杆菌OH11单菌落于含有卡那霉素的LB液体培养基中，在温度为28℃，搅拌速度为200 rpm的条件下过夜培养得到种子液，取种子液按0.5～1.5％的接种量接种至5～15％TSB的培养基中，在搅拌的条件下发酵50～100h，得到产酶溶杆菌OH11发酵液；

(2)调节产酶溶杆菌OH11发酵液pH至2～4后用有机溶剂萃取，萃取后蒸干有机溶剂后得粗提物；

(3)将粗提物采用有机溶剂溶解后，依次采用柱层析法和色谱法分离制备得到目标产物。

本发明技术方案步骤(1)种子液按0.9～1.2％的接种量接种至5～15％TSB的培养基中；发酵过程中保持温度为25～30℃，搅拌的速度为180～220 rpm，发酵的时间为70～75h。

本发明技术方案步骤(1)中卡那霉素的浓度是25μg/mL。

在步骤2)中调节pH值所用的调节剂为盐酸、乙酸、磷酸、硫酸、三氟乙酸、已二酸中的一种或几种。

本发明技术方案步骤(2)中的萃取所用的有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇中的至少一种；优选萃取所用的有机溶剂为乙酸乙酯；进一步优选萃取的次数为3次。

本发明技术方案步骤(3)中的粗产物采用甲醇溶解。