[发明专利]一种仿刺参种质鉴定方法

权利要求书

1.一种仿刺参种质鉴定方法，其特征在于，所述的鉴定方法步骤如下：

(1)样本提取：将疑似仿刺参样本，随机取样5g，加液氮在研砵中研成粉末，取0.05g分装到2mL EP管中，取样至少3支；在不能即时提取DNA时，则-20℃保存备用；按常规的酚氯仿法提取DNA，或者用深加工食品DNA提取试剂盒按操作指南提取DNA；

(2)PCR鉴定：

反应条件：

15μl体系：

模板        0.2μl

2×Taq PCR MasterMix    7.5μl

引物         1.2μl，上下游引物均为2.5μmol/L

ddH₂O        6.1μl

PCR反应程序：

引物序列：

(3)鉴定标准：产物8％聚丙烯酰胺凝胶电泳2.5h，银染显色后扫描仪成像；引物Aja2-111的结果为111bp的一条带；引物Aja13-144的结果为144bp的一条带；引物Aja15-185的结果为185bp和384bp的2条带；

(4)结果判定：用步骤(2)所述的3对引物扩增出如步骤(3)所述的条带时，判定样本是仿刺参。

2.根据权利要求1所述的仿刺参种质鉴定方法，其特征在于，步骤(2)中：所述引物的设计合成方法如下：

(1)将测序得到的引物序列用Seqman程序，进行对比拼接，去除冗余，再将得到的每一个DNA序列输入到SSR软件中，找出每DNA序列的重复序列，以及其重复次数；运用Primer Premier5软件对所有微卫星序列进行引物设计，设计出上游引物和下游引物共23对，将所得到的引物序列进行合成；所设计的引物序列如下表：

(2)仿刺参合成引物的鉴定

PCR扩增：

建立一个15μl的扩增体系：

上下游引物是根据引物合成单上的ODs值与nmoles per OD中的n值向合成引物干粉中添加TE buffer制成引物原液，再将引物原液与TE以1:39的比例稀释40倍后用于扩增体系,浓度为2.5μmol/L,；而模板是4地理群体(采自辽宁大连，河北北戴河，山东东营，江苏连云港的天然水域)24个较好的仿刺参组DNA经过灭菌双蒸水稀释5倍后的稀释液，浓度约为10ng/μl；将这它们用移液枪按要求量移入管中，用过离心将它们混合在一起然后放入PCR扩增仪中进行扩增；

PCR扩增程序

盖顶温度:99℃

PCR产物的检测

扩增出来的PCR产物使用1.0％琼脂糖凝胶电泳进行检测：将混合液扩增产物进行检测，配制好的1.0％的琼脂糖胶液倒入插好梳子的电泳槽中凝固成型，然后拔掉梳子，加入电泳液，没过胶板0.5-1cm，然后用移液枪将5μl的PCR产物和2μl的溴酚蓝指示剂混合均匀后点入琼脂糖凝胶的点样孔中；按下开关后，将电压设置成120V，电流60m然后电泳约30min；电泳结束后营造一个较暗的环境，用手提式紫外线照射仪查看条带电泳情况，是否跑出条带，条带亮度大小；观察之后再将胶板拿到紫外线凝胶呈像系统观察，并拍照记录；将电泳条带较亮的引物筛选出来，作为下一步实验用引物；23对引物中，12对引物的条带亮度较好，较为清晰；最终选定权利要求1所述的3对扩增稳定的引物。