[发明专利]一种甘蓝型油菜育性相关BnCP20基因及其应用

说明书

技术领域：

本发明属于油菜基因工程技术领域，涉及油菜的分子育种领域，具体涉及一种甘蓝型油菜育性相关BnCP20基因及其应用。

背景技术

植物在有性繁殖的过程中不能正常产生花粉的遗传现象称为雄性不育，它涉及到花器官中雄蕊的发生与发育、绒毡层结构、小孢子形成、花药开裂以及外部生态环境等很多环节。其中，绒毡层发育的异常并不影响花粉母细胞的减数分裂，但是影响到四分体的分离和花粉壁的形成，由此可见绒毡层在小孢子发育中起着重要的作用。可以归纳为以下两个方面：1.提供四分体分离所需要的酶类：胼胝质酶和多聚半乳糖醛酸酶，目前研究表明这两种酶都是在绒毡层中合成的(Rhee et al.,2003；Wan et al.,2011)；2.提供花粉外壁发育所需要的各种成分，花粉外壁主要是由孢粉素组成的，孢粉素的主要成分是脂类和酚类的化合物，参与到该类物质合成的基因，一般都是在绒毡层中特异表达的(Ariizumi and Toriyama,2011)。

绒毡层的降解过程是一个精密的调控过程，具有典型的细胞壁分离、染色质聚集、细胞胞质凝缩等细胞程序化凋亡(PCD)的特征。在动物细胞中，半胱氨酸蛋白酶的活性与PCD相关。植物细胞和动物细胞在PCD的表征上具有高度的相似性。因此，绒毡层的PCD可能也与植物的半胱氨酸蛋白酶有关(Wilson and Zhang,2009)。在植物中，半胱氨酸蛋白酶是普遍存在的一种水解酶，参与细胞变性，蛋白质降解以及生物的程序化死亡PCD(Solomon et al.,1999)。在水稻中，OsCP1编码半胱氨酸蛋白酶，该基因的突变会导致小孢子降解，其可能与水稻绒毡层细胞程序性死亡直接相关(Lee et al.,2004)。OsAPI5编码细胞程序性死亡抑制因子，该基因的突变会引起绒毡层PCD的延迟从而导致小孢子的降解(Li et al.,2011)。在拟南芥ms1突变体中，绒毡层降解延迟，PCD的发生转化成细胞的坏死(Vizcay-Barrena and Wilson,2006)。在水稻Ostdr突变体中，绒毡层PCD延迟导致花粉壁的发育失败，随后小孢子降解(Li et al.,2006)。在油菜中，Bnms1和Bnms3突变体的绒毡层细胞程序化凋亡(PCD)都发生了延迟变化(Dun et al.,2011；Yi et al.,2010)。因此，绒毡层PCD的启动时间非常重要，它的启动一般可能发生在四分体早期(Wilson and Zhang,2009)。

在十字花科植物中，A9基因在开花期的早期阶段开始表达，是早期花粉发育所必须的(Aarts et al.1997)，而与其同源的白菜基因BrA9，从花粉母细胞时期到花粉粒的形成阶段，该基因一直在绒毡层中高效表达，融合一个在种子中特异表达的半胱氨酸蛋白酶会导致花药的败育(Konagaya et al.,2008)。

本发明开发了一个影响绒毡层发育相关的半胱氨酸蛋白酶BnCP20基因，通过花药差异表达分析发现，这个基因在可育植株>2mm的花蕾中表达；通过转基因实验证实，用一个白菜基因的花药特异表达的启动子A9启动BnCP20基因表达，可以导致拟南芥或油菜花药发育异常，获得雄性不育植株。申请人的结果预示着BnCP20基因在控制油菜或拟南芥花粉的育性，创造雄性不育转基因新材料中具有相当的应用前景。

油菜作为中国主要的油料作物，在长江流域广泛种植，对国计民生具有重要影响。油菜杂种优势比较明显，雄性不育是杂种优势利用的重要途径。目前，国内外已发现了多种类型的雄性不育材料，在理论和应用方面取得了重要的进展，而新型不育源的发现和研究一直是杂种优势研究的基础，并以此创造出更多的天然和人工不育材料，为油菜育种和生产所广泛应用。

发明内容

本发明的目的在于分离出一个半胱氨酸蛋白酶基因BnCP20，通过RT-PCR发现该基因在可育和不育材料的花蕾存在差异表达，通过blast比对拟南芥，白菜，甘蓝型油菜基因组测序数据库，通过PCR获得该基因的核苷酸序列，该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，该基因编码的蛋白质序列如如序列表SEQ ID NO:1所示，编码351个氨基酸。可以采用已经克隆的多核苷酸作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。同样，采用PCR(polymerase chain reaction)技术，也可以从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的基因以及任何感兴趣的一段多核苷酸或与其同源的一段多核苷酸。