[发明专利]借助游离小孢子培养和EMS诱变创制大白菜突变体的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物细胞工程技术领域，具体涉及一种在游离小孢子培养过程中与EMS诱变相结合创制大白菜突变体的方法。

背景技术

大白菜属于十字花科芸薹属A基因组植物，是我国种植面积最大的蔬菜作物。大白菜的基因组序列已经于2011年释放，其分子生物学研究进入了功能基因组阶段，大白菜突变体是其功能基因组学研究的重要材料。

人工诱变可以产生丰富的突变体材料。人工诱变的方法有很多种，包括物理(如辐射)诱变，化学诱变(如EMS诱变),T-DNA插入诱变和AC/DS转座诱变等。其中，EMS是化学诱变中应用最广泛的诱变剂。与其他诱变剂相比，EMS诱变产生的点突变频率高，且多为显性突变，染色体畸变相对较少。

传统的诱变方法是利用诱变技术处理植株的种子,并在田间对诱变植株进行鉴定和选择。种子是最早也是最常用来作为EMS诱变处理的材料，但通常EMS诱变种子效率很低。游离小孢子培养可以为离体诱变提供新的途径，其在创制突变体方面具有明显的优势，可以快速获得目标性状、缩短创制纯合突变体的时间、提高诱变效率。本发明将游离小孢子培养和EMS诱变相结合，旨在快速创制纯合的大白菜 突变体。

发明内容

本发明的目的是创建一种快速创制大白菜突变体的新方法，将游离小孢子培养技术和EMS诱变相结合，旨在快速获得纯合的大白菜突变体，提高构建突变体库的效率。

本发明提供的借助游离小孢子培养和EMS诱变创制大白菜突变体的方法，主要步骤包括：

(1)所用的诱变材料为双单倍体纯系(DH系)，在开花期选取小孢子发育期为单核晚期至二核早期的未开放花蕾，即长度为2-4mm，进行游离小孢子培养；

(2)在小孢子培养过程中，采用不同浓度0.04％、0.08％、0.12％[v/v]EMS溶液对小孢子进行诱变处理，处理时间均为10min，经过培养获得小孢子再生植株(M₀)；

(3)将M₀代再生植株移栽到温室，利用流式细胞仪对其进行倍性鉴定，筛选出双单倍体植株；

(4)在获得的双单倍体植株中，通过对叶色、叶形、花瓣颜色、花瓣形态、雄蕊育性和株型等植物学性状鉴定，筛选出M₀变异植株；

(5)将所有的M₀代双单倍体植株自交，获得M₁代种子；

(6)播种M₁种子，进一步鉴定突变性状，筛选稳定遗传的突变体材料；

(7)经试验筛选，创制大白菜突变体的适宜EMS溶液浓度为0.08％；

上述步骤(2)的具体内容：将长度为2-4mm的未开放花蕾在超净工作台上经浓度为75％乙醇溶液表面消毒30s后，用浓度为0.1％氯化汞溶液消毒8min，再用无菌水冲洗3次，每次5min。

消毒后的花蕾放入灭过菌的小烧杯内，加入蔗糖浓度为130g·L^-1，PH值为5.8的B5培养基，用无菌研棒碾压花蕾，使小孢子游离出来，用40μm孔径的尼龙网过滤含小孢子的悬浮液，收集滤液于10mL离心管中，1000rpm离心3min，弃上清液，沉淀加10mL B5培养基，摇匀，1000rpm离心3min，弃上清液，所得沉淀物即为纯净小孢子。此时，分别加入浓度为0(对照)，0.04％，0.08％，0.12％(v/v)的EMS溶液，摇匀，处理10min后，1000rpm离心3min，弃上清液，将诱变处理后的小孢子用NLN培养基稀释，稀释密度至1～2×10⁵个·mL^-1，以每皿5mL小孢子悬浮液分装入直径60mm的无菌培养皿内,每皿添加100μL高温灭菌后的0.5g·L^-1琼脂糖和10g·L^-1活性炭混合液；用石蜡膜封口，33℃恒温箱中暗培养24小时,再转移至25℃培养箱暗培养10～15天，肉眼可见胚状体后，将培养皿转移到转数为40～60转/分钟摇床上继续暗培养，培养温度为25℃；将子叶期胚状体转接到MS培养基上，在25℃，16h/8h光周期条件下培养；获得小孢子再生植株后，再进一步将再生植株接种到MS培养基上进行生根培养。

EMS溶液设0.04％，0.08％，0.12％(v/v)3个浓度梯度，将EMS溶于蔗糖浓度为130g·L^-1，PH值为5.8的B5培养基中，抽滤备用，以未处理的小孢子作对照。