[发明专利]一种利用CTAB提取土壤微生物基因组DNA的方法

权利要求书

1.一种利用CTAB提取土壤微生物基因组DNA的方法，包括土壤杂质的去除与微生物细胞的破碎，杂蛋白的抽除，DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除，DNA洗脱，     其特征在于：所述方法具体包括以下步骤：

1）土壤杂质的去除与微生物细胞的破碎：称取土壤于离心管中，每1-10g土壤中加入10-20ml裂解液，震荡裂解1-10min，于60-70°C温育1-2h，温育期间每5-10min震荡1-2次；温育后，10000-12000rpm/min离心20-30min，取一次上清液至无菌的离心管中，加入0.125-0.2倍一次上清液体积的1-10mol/L醋酸钾和0.4-1倍一次上清液体积的质量浓度40-60%聚乙二醇-800，于-20°C静置30-60min，然后10000-12000rpm/min离心20-60min，弃废液后加入15-25ml CTAB-NaCl-EDTA溶液，然后于65-80°C温育30-60min;

2）杂蛋白的抽除：在上述离心管中加入15-20ml 抽提液A抽提，10000-13000rpm/min 离心10-30min，取二次上清液至无菌的离心管中，加入15-20ml 抽提液B抽提，10000-13000rpm/min 离心10-30min，取三次上清液至灭菌的离心管中；

3）DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除：在上述离心管中加入与三次上清液等体积的沉淀剂，混匀后加入DNA吸附柱中，然后10000-13000rpm/min 离心1-5min，弃废液，加入200-600μl去蛋白液，然后10000-13000rpm/min 离心1-5min，弃废液，加入200-600μl漂洗液，然后10000-13000rpm/min 离心1-5min，弃废液，加入200-600μl漂洗液，然后10000-13000rpm/min 离心1-5min，弃废液，将DNA吸附柱静置吹干；

4）DNA洗脱：往DNA吸附柱中加入100-200μl洗脱液，然后10000-13000rpm/min 离心1-5min，所得液体为土壤微生物基因组DNA；

所述裂解液由终浓度 0.25-1mol/L氯化钠，终浓度0.1-1 mol/L乙二胺四乙酸，质量体积比4-8%十二烷基硫酸钠和终浓度0.3-1 mol/L 异硫氰酸胍组成；

所述CTAB-NaCl-EDTA溶液由质量体积比1-5%十六烷基三甲基溴化铵,终浓度1-2 mol/L氯化钠和终浓度0.1-0.5 mol/L乙二胺四乙酸组成；

所述抽提液 A是指体积比为酚:氯仿:异戊醇=25:24:1的混合液；

所述抽提液 B是指体积比为氯仿:异戊醇=24:1的混合液；

所述沉淀剂是指质量浓度70-80%乙醇；

所述去蛋白液是由终浓度3-6mol/L盐酸胍和终浓度20-50 mmol/L Tris-HCl组成，pH=6-7，使用前加乙醇，使得去蛋白液中乙醇质量浓度为30-40％；

所述漂洗液由终浓度10-30mmol/L NaCl和终浓度1-5mmol/L Tris-HCl组成，pH=7-8, 调完pH后加入乙醇，使得漂洗液中的乙醇质量浓度为80-90%；

所述洗脱液是指10-30mmol/L Tris-HCl，pH= 8-9。

2.根据权利要求1所述的一种利用CTAB提取土壤微生物基因组DNA的方法，其特征在于：所述裂解液由终浓度 0.25mol/L氯化钠，终浓度0.1 mol/L乙二胺四乙酸，质量体积比4%十二烷基硫酸钠和终浓度0.35 mol/L 异硫氰酸胍组成。

3.根据权利要求1所述的一种利用CTAB提取土壤微生物基因组DNA的方法，其特征在于：所述CTAB-NaCl-EDTA溶液由质量体积比2%十六烷基三甲基溴化铵,终浓度1.4 mol/L氯化钠和终浓度0.1mol/L乙二胺四乙酸组成。

4.根据权利要求1所述的一种利用CTAB提取土壤微生物基因组DNA的方法，其特征在于：所述去蛋白液是由终浓度5mol/L盐酸胍和终浓度20 mmol/L Tris-HCl组成，pH=6.6，使用前加乙醇，使得去蛋白液中乙醇质量浓度为38％。