[发明专利]灵芝锰过氧化物酶毕赤酵母基因工程菌株构建及应用

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种分子生物学、基因工程领域的技术，具体是一种毕赤酵母基因工程菌株构建及其该菌株在生产锰过氧化物酶中的用途。

背景技术

锰过氧化物酶(Manganese peroxida，MnP)是一类糖蛋白，由一系列糖基化的含有一个Fe(s)‐卟啉环(IX)血红素辅基的同工酶组成，等电点4.2～4.5，真菌产生的MnP分子量在38～62.5kDa，大多数纯化酶的分子量大约在45kDa左右，其酶活中心是由一个血红素基和一个Mn²⁺构成，还有两个起稳定结构作用的Ca²⁺，其分子由十条长的蛋白质单链和一条短的单链构成。其活性不仅依赖于H₂O₂，还依赖于Mn²⁺的存在，在离体条件下能分解芳香环多聚体(Zhou XW，Cong WR，Su KQ，Zhang YM.Ligninolytic enzymes from Ganoderma spp.‐Current status and potential applications.Critical Reviews in Microbiology.2013，39(4):416‐26)；因而具有极高的工业应用潜力，可在生物制浆、纸浆的酶法漂白、有机污染物的降解和环境的生物修复等方面得到有效的应用，另外在褐煤的生物转化过程中起重要的作用，可减少能源浪费和环境污染(王蓓，王圆，周晓云，芦国营.锰过氧化物酶(MnP)的研究进展.化工技术与开发.2005,34(4):28‐31)。MnP被认为是降解木质素和异生芳香化合物的关键酶(Hakalaa T K，Lundella T，Galkina S，et al.Manganese Peroxidases，Laccases and oxalic acid from the selective white‐rot fungu Physisporinus rivulosus grown on spruce wood chips.Enzyme and Microbial Technology，2005，36:461‐468),尤其在染料脱色方面。

天然的MnP主要来自于真菌，目前已知产MnP的58种真菌主要是一些白腐真菌，多属担子菌亚门、无隔担子菌亚纲、无褶菌目的多孔菌科(赵士豪，赵学库，杨丽宁.锰依赖过氧化物酶研究进展.安徽农业科学,2007，35(4)：957‐95)。在MnP降解异生芳香化合物的研究中，前人研究证明，在以MnP为主要木质素酶的脱色体系中，香菇Lentinula edodes对染料刚果红、RBBR、Poly R‐478、台盼蓝、乙基紫和甲基绿的脱色率达到92.0％‐98.0％；白腐真菌菌株L‐25及其MnP对多种偶氮、葸醌类染料的脱色率达到84.9％‐99.6％；在原毛平革菌属的Phanerochaete sordida对活性艳蓝、活性艳橙、活性艳红、活性深绿4种染料混合液的脱色过程中，MnP起主要作用，脱色率达到90.0％(李旭东，荚荣，程晓滨，等.锰过氧化物酶的固态发酵及其对染料的脱色作用.环境科学学报，2008，28(3):490‐495)。吕聪等报道了锰过氧化物酶对染料刚果红的最佳脱色条件，并利用多孔菌科真菌茯苓Poria cocos在液体发酵条件下产锰过氧化物酶，并对其用于染料结晶紫降解脱色进行了研究(吕聪,曹福祥,董旭杰.锰过氧化物酶对染料刚果红脱色工艺条件的初探.造纸化学品与应用.2008,(2):17‐18.吕聪,曹福祥,董旭杰.锰过氧化物酶对结晶紫脱色的研究.中南林业科技大学学报.2008，28(3):172‐174)。目前，木质素酶(包括MnP)的研究大多利用合成培养基进行液态发酵，需添加昂贵的诱导物藜芦醇等，并且发酵周期长、成本高、酶活低。20世纪90年代，固态发酵开始受到重视.固态发酵可模拟白腐真菌的自然生长环境，与液态发酵相比产量更高、操作更简单、成本也更低(李旭东，荚荣，程晓滨，等.锰过氧化物酶的固态发酵及其对染料的脱色作用.环境科学报，2008，28(3):490‐495)。但固态发酵酶的分离纯化成本较高，增加了进行环境修复的成本。