[发明专利]产漆酶大斑刚毛座腔菌及利用该菌株制备漆酶的方法

说明书

本发明涉及真菌发酵技术领域，特别涉及产漆酶大斑刚毛座腔菌及利用该菌株制备漆酶的方法。本发明提供了保藏编号为CGMCC NO：9857大斑刚毛座腔菌，并提供了利用该菌株制备漆酶的方法。本发明提供的大斑刚毛座腔菌生长周期短，7天即可完成发酵，获得漆酶，能够显著提高生产效率。获得漆酶的酶活力高达39600U/L，能够满足实际生产的需求。

技术领域

本发明涉及真菌发酵技术领域，特别涉及产漆酶大斑刚毛座腔菌及利用该菌株制备漆酶的方法。

背景技术

漆酶(Laccase EC 1.10.3.2)是一种催化中心含有铜离子的多酚氧化酶，也称为多铜氧化酶，以分子氧作为电子受体，催化氧化多种酚类及芳胺类化合物及其衍生物脱去羟基上的电子或质子，形成自由基，导致酚类及木质素类化合物裂解。从目前已报道的文献初步统计，其催化的不同类型的底物已达200多种，包括酚类(主要是邻、对苯二酚等多元酚)、芳胺类、羧酸、甾体激素、生物色素、二茂铁类化合物及以上各种衍生物，漆酶还可以氧化抗坏血酸、吲哚衍生物及木质素等一些非酚类底物。在降解木质素方面，漆酶主要攻击木质素的苯酚结构单元，可以直接与木质素底物相互作用，也可以在中间氧化产物存在的情况下，与更广泛的底物作用。

正是由于这种良好的底物广泛性，漆酶在很多行业中都有很好的应用前景。已经报道的漆酶的应用主要集中于造纸行业的脱木质素和印染行业的废水处理中，此外近几年漆酶在生物质能源、有机合成生物转化和传感器的制造也有较多的研究。

长期以来，国内外对真菌漆酶的研究集中于担子菌亚门如Pycnoporuscinnabarius、 Trametes gallica等，但因生长周期长、产量低、反应需要介质体系而限制了应用。大斑刚毛座腔菌(Setosphaeria turcica)是导致玉米大斑病发生的丝状病原真菌，主要危害玉米叶片、叶鞘和苞叶。研究表明，大斑刚毛座腔菌含有能够表达漆酶的基因，经培养亦证实大斑刚毛座腔菌能够发酵产生漆酶。分析认为，大斑刚毛座腔菌漆酶可降解玉米叶片木质素，有助于病菌侵入寄主玉米组织。

发明内容

本发明的目的是提供产漆酶大斑刚毛座腔菌及利用该菌株制备漆酶的方法。本发明提供的大斑刚毛座腔菌产生的漆酶具有较高的酶活力，本发明提供的制备漆酶的方法，产量高，周期短。

本发明提供了一种大斑刚毛座腔菌，保藏编号为CGMCC NO：9857。

本发明还提供了保藏编号为CGMCC NO：9857的大斑刚毛座腔菌在制备漆酶中的应用。

本发明提供的保藏编号为CGMCC NO：9857的大斑刚毛座腔菌菌株通过对玉米大斑病病斑标样培养、筛选得到。具体方法为：

步骤1：取采集自辽宁省新宾市的玉米大斑病病斑标样，在病斑的病健交界处剪取3mm²的叶片，以体积分数为75％的酒精水溶液中表面消毒15s后，于质量分数为0.1％的HgCl₂溶液中消毒40s，以无菌水冲洗3次后，置于PDA平板中，25℃黑暗培养5d～7d；

步骤2：取步骤1中经黑暗培养的PDA平板打菌盘，取单个菌盘接种到含ABTS和苯胺蓝的PDA固体培养基，20℃～25℃黑暗培养10d；

步骤3：取步骤2培养后显色圈直径大颜色深的菌株，接种于PDA培养基，培养7d，取单个菌盘分别接种于Fries液体培养基，加入CuSO₄至终浓度为0.25μmol/L，20℃～25℃黑暗培养10d后，取胞外酶活及胞内酶活皆较高的菌株即为保藏编号为CGMCC NO：9857的大斑刚毛座腔菌。

本发明提供的大斑刚毛座腔菌，生长周期短，产漆酶量及产生漆酶的活力皆较高，采用本发明提供的大斑刚毛座腔菌菌株制备漆酶，能够显著提高生产效率。

本发明还提供了大斑刚毛座腔菌制备漆酶的方法，包括如下步骤：