[发明专利]一种MES,NHS残留的HPLC检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种MES,NHS残留的HPLC检测方法。

背景技术

在现今较为稳定的化学交联方法中，碳二亚胺的交联体系越来越受到关注，碳二亚胺的交联体系能够应用于生物多糖、多肽、蛋白质，核酸以及高分子改性等各个生物、有机合成等领域，其本身毒性小，交联效果迅速，结果稳定等优点都极好地弥补了传统采用甲醛，戊二醛交联方式所带来的安全性等问题。相比于热交联等物理交联方法而言，碳二亚胺的交联体系更为稳定，交联出的产品更加均一。2-吗啉乙磺酸（MES）在交联体系中提供较为稳定的pH范围，为EDC的交联反应提供稳定的酸碱环境，N-羟基丁二酰亚胺(NHS)为交联反应中稳定交联产生的中间体。这两种物质在碳二亚胺的交联体系中为交联提供条件的重要物质，在制药工程中，NHS还是半合成卡那霉素及医药中间体的原料。在交联工艺完成以后，交联剂本身的残留定量检测就成为一个亟待解决的问题，在ICH(The International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use人用药物注册技术要求国际协调会议）在《Q3AR2：新原料药中杂质》中规定，每日最大剂量的药物中，其含有的杂质界定阈值为0.1%或者1mg，现今，对于MES和NHS作这两种交联物质的微量残留检测方法还不完善。这为碳二亚胺交联体系在药物或者医疗器械的广泛应用带来了限制，筛选一种MES和NHS有效的检测方法对于碳二亚胺交联体系的广泛应用有着重要意义。

2-吗啉乙磺酸（MES）和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)这两种物质极性较大，其在水中的溶解度较大，这实际上为两种物质实现单独定量增加了困难。

发明内容

针对现有技术中的上述问题，本发明提供了一种精确度较高，能够满足实际需求的MES,NHS残留的HPLC检测方法。

本发明的MES,NHS残留的HPLC检测方法，采用反相C₁₈硅胶键合色谱柱，流动相由pH值为6.5~6.8的磷酸盐缓冲液和有机溶剂组成，检测波长205~210nm；所述有机溶剂为甲醇或乙腈。

其中所述的磷酸盐缓冲液为《中华人民共和国药典》2010年版二部，附录ⅩⅤ D缓冲液部分记载的pH值在6.5~6.8范围内的磷酸盐缓冲液。

HPLC检测方法具有定量准确、检测周期短等优点，是较为适于进行微量检测的方法之一。而要实现MES和NHS的HPLC单独定量检测就必须首先实现这两种物质之间的分离度R≥1.5。经过研究发现，两种物质的分离度和流动相的组分，流动相的pH值，流动相配比等多种因素相关，综合性考察各方面因素后得出上述检测方法，能够获得良好的分析结果。

作为优选方案，所述磷酸盐缓冲液与有机溶剂的体积比为95:5~98:2。由于MES和NHS都极易溶于水而从色谱柱中洗脱出来，会导致保留时间不够而分离度较低，所以有机溶剂的体积含量不能太大，水相和有机相的体积比在95:5~98:2比较合适，满足MES和NHS两种物质之间的分离度R≥1.5的要求。其中以磷酸盐缓冲液与有机溶剂体积比为97:3的比例混合最佳，采用单通道分析，最大程度克服因为高效液相色谱仪的泵头计量等因素，在水相和有机相比例悬殊时可能会导致的计量不准确问题。

作为优选方案，所述有机溶剂为甲醇。MES和NHS在甲醇中的保留时间差别较大，更有利于两种物质的单独定量检测，磷酸盐缓冲液和甲醇体积比为97:3，选择该比例的混合液作为流动相， MES和NHS的分离度可以达到2.3，可以保证检测结果更加精确。

作为优选方案，磷酸盐缓冲液的pH值为6.5，用该pH值的磷酸盐缓冲液与有机相组成的流动相，相较于其他pH值分离效果更优。

作为优选方案，检测波长为210nm。选择该检测波长值，能够进一步降低边缘吸收。

作为优选方案，流动相流速为1.0mL/min。流速过快会导致分离物质太快出峰，分离度不好，过慢会导致物质峰形变宽而影响峰形，本发明的检测方法中1.0mL/min的流速最为适合。

作为优选方案，反相C₁₈硅胶键合色谱柱可以选择商品ZORBAX.SB-C18。这种类型的色谱柱能够较好适用于本发明方法且价格相对便宜，可以降低检测成本。