[发明专利]一种具有生产和回收β-果糖基转移酶双重功能的酵母菌株的构建

说明书

技术领域

本发明属于酶工程领域，具体涉及一种具有生产和回收β-果糖基转移酶双重功能的酵母菌株的构建。

背景技术

β-果糖基转移酶能够在蔗糖的果糖基上连接1-3个果糖基而形成一系列果糖寡聚体。低聚果糖是一种水溶性膳食纤维，长期服用可以降低血清胆固醇，改善脂质代谢，经动物和人体实验证实。人体摄入低聚果糖后，体内有益菌群双歧杆菌数量可抑制外源致病菌和肠内固有腐败细菌如沙门氏菌等生长繁殖，减少肠内腐败物质的生长和积累，促进肠道蠕动，防止便秘和腹泻。低聚果糖是一种优良的水溶性膳食纤维，能有效降低血清胆固醇、甘油三脂、游离脂肪酸的数量，对于因血脂高而引起的高血压、动脉硬化等一系列心血管疾病有较好的改善作用。低聚果糖在大肠内被细菌发酵生成L-乳酸，可以溶解钙、镁、铁等矿物质，促进 人体对矿物质的吸收。 实验证实，低聚果糖促进钙的吸收率达70.8%。因此，低聚果糖可以促进生长发育和防止骨质疏松症。同时还可促进维生素B1、B2、B3、B6、B12及叶酸的自然形成，从而提高人体新陈代谢水平，提高免疫力和抗病力。预防及改善由于体内毒而引起的皮肤性疾病，可防止面疮、黑斑、雀斑、青春痘、老人斑，使皮肤亮丽、老化减缓。双歧杆菌吸收低聚果糖后，迅速增殖，抑制大肠杆菌、沙门氏菌和梭状芽胞杆菌等腐败菌发生作用，减少毒性代谢物（如吲哚、亚硝基氨）的生成，同时迅速将毒性代谢物排出体外，减轻肝脏负担，起到保护肝脏的作用，预防各种慢性病、癌症等作用明显，低聚果糖极少会被消化道中的胃酸和酶分解，极难被人体吸收。据测定，低聚果糖的热值为1.5Kcal/g以下，而蔗糖热值为4.6 Kcal/g，因此摄入低聚果糖后，不会引起肥胖，是理想的、低热值的功能性甜味剂。低聚果糖不能被突变链球菌利用生成不溶性葡聚糖而提供口腔微生物沉积/产酸和腐蚀的场所（牙垢），因此可以防止龋齿。低聚果糖生产的关键是生产低成本的果糖转移酶。

液体发酵具有发酵体积大，易实现自动化控制等特点，因而液体发酵在许多产品的生产上体现出巨大优势。特别是在现在劳动力成本上升，国际大力推进机械化和自动化背景下，液体发酵具有更广阔的空间。β-果糖基转移酶的生产也有越来越倾向于液体发酵的优势。但是液体发酵生产的酶类产品浓度低的特征。生产的β-果糖基转移酶等都游离在发酵醪液中，为得到高浓度的β-果糖基转移酶的固体坟墓，需要对发酵醪液进行浓缩。为纯化浓缩β-果糖基转移酶往往需要通过真空蒸发或喷雾干燥等工艺来浓缩。在蒸发浓缩或喷雾干燥的过程中，β-果糖基转移酶的活性丧失一部分，而且浓缩工艺大幅度提高了生产成本，在蒸发或喷雾干燥的过程中，消耗大量的能源如电或燃气等。因此降低浓缩成本，成为降低液体发酵生产β-果糖基转移酶生产成本的必然选择。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种具有生产和回收β-果糖基转移酶双重功能的酵母菌株。

本发明的另一目的在于提供用于构建上述酵母菌株的DNA片段。

本发明的再一目的在于提供用于构建上述酵母菌株的质粒。

本发明的目的还在于提供上述酵母菌株的构建方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

用于构建具有生产和回收β-果糖基转移酶双重功能的酵母菌株的DNA片段，包括按顺序排列的酿酒酵母TDH3启动子序列、酿酒酵母分泌信号肽编码序列、β-果糖基转移酶编码序列、酿酒酵母凝聚因子C端的400个氨基酸片段编码序列、酿酒酵母TDH3终止子序列；上述序列分别如SEQ ID NO.1～5所示。

优选的，所述的用于构建具有生产和回收β-果糖基转移酶双重功能的酵母菌株的DNA片段的序列如SEQ ID NO.6所示。

用于构建具有生产和回收β-果糖基转移酶双重功能的酵母菌株的质粒为包含上述DNA片段的真核表达质粒。所述的真核表达质粒优选为pPIC9K质粒。

所述的用于构建具有生产和回收β-果糖基转移酶双重功能的酵母菌株的质粒通过包含如下步骤的方法制备得到：合成两端有限制性内切酶识别位点含有上述DNA片段的序列，通过限制性内切酶连接到真核表达质粒上。所述的真核表达质粒pPIC9K质粒时，限制性内切酶优选为BglⅡ和FspAⅠ。

一种具有生产和回收纤β-果糖基转移酶双重功能的酵母菌株，含有上述质粒。所述的酵母菌株优选为酵母菌株 SMD1168。

所述的具有生产和回收β-果糖基转移酶双重功能的酵母菌株的构建方法，包括如下步骤：制备酵母电转化感受态细胞，将上述质粒通过电转化转进酵母中得到。

本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：