[发明专利]检测外周血单核细胞中HBcAg的表达的方法

说明书

技术领域

本申请涉及一种检测外周血单核细胞中HBcAg表达及分布的方法。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)存在于完整的Dane颗粒的核心内，该核心是HBV的结构蛋白即病毒核壳蛋白，具有重要的生物学特征和临床病理意义。既往研究证明血HBcAg阳性可以提供肝内HBV合成的信息，是病毒存在的直接标志。HBcAg感染的肝细胞是细胞免疫效应攻击的靶细胞，肝细胞溶解后HBcAg可以直接释放入血，故能直接反映肝细胞损害和病情进展的阶段。

发明内容

本发明提供一种新的检测HBcAg表达及分布的方法。

本发明提供一种检测外周血单核细胞中HBcAg表达及分布的方法，其使用共聚焦显微镜进行检测。

所述方法包括如下步骤：a)提取外周血单核细胞；b)将外周血单核细胞进行免疫荧光抗体包被；c)利用激光共聚焦显微镜检测。

所述步骤c中，建立二条通道，分别为一条用于寻找细胞的DAPI通道和一条用于观察HBcAg绿色荧光的GFP通道。

一种使用共聚焦显微镜检测外周血单核细胞中HBcAg分布的方法。

本发明的有益效果是：激光共聚焦显微镜可以动态监测外周血单核细胞(PBMC)中HBcAg表达水平及分布的变化，从而评估HBV DNA复制水平，能够应用在慢性乙型肝炎抗病毒治疗疗效及患者免疫状态的研究上。

附图说明

图1是本实施方式利用Spearman’s分析第一组所有血和PBMC标本中HBV DNA表达水平相关性的结果图；

图2是在63×3放大倍数下，PBMC中的HBcAg阳性表达图，其中A为抗乙型肝炎核心抗原的抗体；B为DEPI，C为前两图叠加效果；

图3是在63×3放大倍数下，PBMC中的HBcAg阴性表达图，其中A为抗乙型肝炎核心抗原的抗体；B为DEPI，C为前两图叠加效果；

图4是在63×放大倍数下计数HBcAg表达阳性的PBMC图，其中A为抗乙型肝炎核心抗原的抗体；B为DEPI，C为前两图叠加效果；

图5是利用Spearman’s分析阳性PBMC百分比与PBMC中HBV DNA水平相关性的结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

一、患者与分组

该实验纳入的患者为北京大学深圳医院感染科门诊及住院部确诊的慢性乙型病毒性肝炎患者。健康对照组成员为该院医务工作者，血清中HBsAg与HBcAb均阴性。所有受试者血中HIV、HCV、HDV抗体阴性。

第一组：25个未抗病毒治疗的慢乙肝患者(包括免疫清除、免疫耐受及HBV或HBsAg携带等所有免疫阶段的患者，见表1)；

第二组：12个干扰素治疗疗程1年后血病毒转阴的慢乙肝患者；

第三组：3个健康患者。

二、实验方法：

1：外周血单核细胞(PBMC)提取：抽取受试者外周血4毫升，在4小时内通过梯度离心法获得细胞，使用PBS洗涤3次，随后悬浮于500ulPBS中存于4℃冰箱。

2：外周血单核细胞免疫荧光方法

1)涂片：将提取的细胞打匀，用枪转移适量至PLL处理好的载玻片上，用枪头平着推开液滴，铺平。自然风干(时间约15～20分钟)。

2)多聚甲醛固定30min；

3)PBS(PH7.4)浸洗3次，每次3min；

4)0.3％TritonX-100PBS，室温孵育30min(配方：10xPBS稀释成1xPBS，加入0.3％TritonX-100)；

5)PBS(PH7.4)浸洗3次，每次3min；

6)去电荷试剂4滴孵育30分钟，PBS浸洗1次5min；

7)每块标本滴加50μl稀释后的一抗体(购买于Millipore公司，稀释倍数1：100)，4℃孵育16h；

8)PBST浸洗5次，每次5min；

9)每张片滴加50μl稀释后的荧光二抗(购买于Invitrogen公司，按照1:200与PBST进行稀释，PBST配制：0.2％Tween-20加入到PBST中)避光孵育40min，PBS洗2min；

10)PBST浸洗3次，每次10min；

11)每张片滴加50μl DAPI，室温放置3min；

12)PBST浸洗5次，每次5min；