[发明专利]中期因子mRNA在肺癌患者外周血中的表达及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及中期因子mRNA在癌症诊断中的应用，尤其是外周血中中期因子mRNA用于非小细胞肺癌鉴别诊断的应用。

背景技术

肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均位于恶性肿瘤之首。非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC)约占其80％，近些年疗效虽有提高，但长期生存率仍较偏低，绝大多数患者确诊时已是癌症晚期，只能采取姑息性治疗，预后较差。

中期因子(midkine,MK)是一种分泌型肝素结合生长因子,为低分子量的蛋白质。MK大量表达于妊娠中期并在妊娠的发展中起着重要的作用。在成人,MK被限制在一定的组织中表达。然而,在肿瘤发生,炎症和组织细胞修复的过程中,MK的表达明显增强。近年发现MK在多种实体瘤中过表达,在癌前病变和肿瘤潜伏期也呈高表达,因此MK可能成为新的肿瘤标记物.MK与恶性肿瘤的关系不十分清楚,但一些实验已证实MK参与肿瘤生长、血管生成、多药耐药形成等过程.应用MK反义寡脱氧核糖核苷酸(MKasODN)或MK启动子进行基因治疗,可能成为基因治疗的新靶点.

本发明拟通过建立外周血荧光定量PCR检测MKmRNA的表达方法，比较和分析了外周血中MK mRNA的表达水平在不同人群(NSCLC患者，LEL患者，正常体检者)中的表达差异及与NSCLC的临床病理特征的关系，并对其作为NSCLC的诊断标志物的可行性进行了探讨。

在实施过程中，本发明人成功建立了外周血中MK mRNA的荧光定量PCR检测方法，发现外周血中MK mRNA的表达水平在NSCLC患者，LEL患者，正常体检者间存在显著性差异，且其高表达水平与NSCLC的临床分期、淋巴结转移，细胞分化程度有显著的相关性。在鉴别诊断NSCLC患者和正常人时，ROC曲线下面积AUC值为0.814(95％CI＝0.738 to 0.894)，在鉴别诊断NSCLC患者和LEL患者时，ROC曲线下面积AUC值为0.759(95％CI＝0.673 to 0.846)，将cut-off值设在0.0063时，MKmRNA鉴别诊断NSCLC患者与LEL患者和鉴别诊断NSCLC患者和正常人的敏感性和特异性分别为57.47％和93.33％；以及56.32％和93.33％。此外，Logistic回归分析认为，外周血中MK mRNA的高水平表达是NSCLC发生的独立危险因素。

发明内容

本发明通过建立外周血MKmRNA的Taqman荧光定量PCR法检测方法，比较NSCLC患者、LEL患者、健康体检者外周血中MK mRNA的表达水平，并分析其表达水平与NSCLC临床病理特征的相关性，通过ROC曲线和多元Logistic回归分析，发现NSCLC患者外周血中MK mRNA表达可以作为诊断NSCLC的肿瘤标志物。

本发明建立了敏感、特异、稳定的NSCLC外周血MK mRNATaqman探针real time PCR检测方法：

(1)培养肺癌细胞A549，抽提总RNA，合成cDNA，

(2)设计PCR扩增引物，扩增获取目的基因MK和内参基因GAPDH的扩增片段；

MK引物：

MK-For：5’-CGCGGATCCATGCAGCACCGAGGCTTC-3’

MK-Rev：5’-CCCAAGCTTCTAGTCCTTTCCCTTCCCTTTC-3’

GAPDH引物序列：

GAPDH-For：5’-CCGGAATTCCTTCGCTCTCTGCTCCTCCTG-3’

GAPDH-Rev：5’-CCGCTCGAGCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGCTG-3’

(3)PCR片段转化、链接、筛选、测序，构建质粒pET28a–MK，pET28a–GAPDH；

(4)设计Real-Time PCR引物探针

MK引物及探针：

MK-For：5’-CATCACACGCACCCCAGTT-3’

MK-Probe：5’-CTTGCAGTCGGCTCCAAACTCCTTCTT-3’

MK-Rev：5’ATTGCGGCGTGGGTTTC-3’

GAPDH引物及探针：

GAPDH-For：5’-CTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCC-3’

GAPDH-Probe：5’-CCAAATCCGTTGACTCCGACCTTCA-3’