[发明专利]一种检测水体类金属砷的微生物学方法

权利要求书

1.一株大肠埃希氏菌WMC-011p的应用，其特征在于所述大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)WMC-011p CGMCC No.9760应用于水体类金属砷的检测。

2.根据权利要求1所述的一株大肠埃希氏菌WMC-011p的应用，其特征在于大肠埃希氏菌WMC-011p构建方法，包含以下步骤：(1)采用Red重组系统敲除赋予野生型大肠埃希氏菌MC4100砷抗性的arsB基因；

(2)设计araB基因N末端和C末端的内侧引物和外侧引物以及pars-arsR-gfpmut2基因的引物，采用交叉PCR技术构建含有报告基因pars-arsR-gfpmut2与araB基因的两端同源臂的融合PCR片段；

(3)将步骤(2)所得片段克隆到pMD18-T载体上，构建pars-arsR：：gfpmut2-T重组载体；

(4)测序分析正确的重组载体pars-arsR：：gfpmut2-T经双酶切切下目的条带连接到pKOV载体上，构建融合报告载体pKOV-ars-arsR：：gfipmut2；

(5)将所述重组载体pKOV-ars-arsR：：gfpmut2转入到步骤(1)所得的大肠埃希氏菌菌株中，通过两次同源重组，将ars-arsR：：gfpmut2报告基因置换到步骤(1)所得的大肠埃希氏菌ΔarsB菌株基因组中的araB编码基因位置。

3.根据权利要求1所述的一株大肠埃希氏菌WMC-011p的应用，其特征在于大肠埃希氏菌WMC-011p菌株检测水体中类金属砷的标准化流程为：(1)取5-10μl E.coli WMC-011p冻存菌液接种于5ml LB培养基中，37℃，250rpm，过夜培养；

(2)取步骤(1)中1％体积过夜菌种子液加入到含有终浓度为40mM MOPS缓冲成分的LB培养基中；

(3)将步骤(2)中菌液37℃，250rpm，培养至OD600值为0.4-0.6范围，加入不同浓度的As³⁺或者pH值范围为0.48-13.74的待检测水样，37℃、250rpm振荡孵育2-8h；

(4)待测菌株样品处理：将步骤(3)中菌液4000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于1ml DB缓冲液中，其中含有20μg/ml氯霉素用于阻止新的GFP蛋白的合成，然后将重悬菌液稀释0-20倍，为了使背景散射和内滤效应最小化，需要E.coli WMC-011p全细胞悬浮液的OD600≤0.3；

(5)用分光光度计测步骤(4)中处理后样品OD600值，荧光分光光度计测其荧光值；

(6)在10^-7-10^-4mol/L的As³⁺浓度范围内，E.coli WMC-011p菌株中GFPmut2的表达量和荧光强度都与As³⁺浓度呈剂量依赖关系；根据同批次已知浓度的砷离子标准溶液诱导制作绿色荧光强度标准曲线及其方程，数据处理，将测得的未知环境水体样品荧光强度值代入方程，计算得到未知环境水体样品中砷的浓度。