[发明专利]一种制备头孢菌素C酰化酶固定化酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术下游工程制药领域，具体地涉及一种头孢菌素C酰化酶固定化酶的制备方法。

背景技术

近年来，由于头孢菌素类抗生素过敏反应小，对和β-内酰胺酶较稳定，具有抗菌谱广、疗效好、毒低、同其他抗生素无交叉耐药性、与青霉素较少产交叉过敏反应等优点，已经成为抗感染最重要的有效药物。研究发现，头孢菌素的抗菌部为其母核7-氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid,7-ACA)，因此作为合成半合成头孢菌素重要中间体，7-AC A的研究生产显得至关重要。头孢菌素C(Cephalosporin C,CPC)经化学法或是酶法裂解得到7-ACA。化学法的反应条件较为苛刻，反应过程必须在超低温条件下进行，而且涉及到大量有毒有害的有机溶剂，会带来环境污染等问题。因此，对环境友好的酶法开始成为工业生产的新方向。在酶法制备7-ACA的过程中，无论一步酶法或两步酶法，都需要头孢菌素酰化酶(Cephalosporin C CPCAlase，CPCA)的作用，才能最终得到产物7-ACA。因此，头孢菌素酰化酶的研究成为酶法合成7-ACA实现工业化的基础。

目前使用两步酶法制备7-ACA在生产成本和环境保护方面有优势，但是从头孢菌素C到7-ACA的转化率与化学法相比要低，而且DAAO催化反应难以控制。头孢菌素C酰化酶(CPC acylase)可以直接把头孢菌素C转变成7-ACA(不经过GL-7-ACA等中间产物)，利用头孢菌素C酰化酶生产7-ACA的一步酶法既具有化学法的优势(高转化率和纯度)也具有两步酶法的优势(高经济性和环境保护)。但是野生型的头孢菌素C酰化酶活力较低，亟需提供一种方法制备头孢菌素C酰化酶固定化酶，以提高酶的活性和稳定性，从而胜任工业化生产的需要。

发明内容

本发明的目的即是开发出一种简便、高收率、适用于工业化生产的头孢菌素C酰化酶固定化酶的制备方法。

为了实现上述目的，本发明提供了一种制备头孢菌素C酰化酶固定化酶的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将大肠杆菌发酵液用陶瓷膜浓缩后，用磷酸盐缓冲液透析，收集浓相菌液；高压破碎后，得细胞破碎液；

(2)在步骤(1)所得细胞破碎液中加入由硫酸铝、硫酸亚铁和中性聚丙烯酰胺组成的混合絮凝剂，在室温下絮凝；加入硅藻土，搅拌均匀后离心，收集上清液；

(3)在步骤(2)所得上清液中加入复合硫酸盐，充分溶解后，加热至45～55℃，维持25～35min；冷却至室温后，加入硅藻土，搅拌均匀后离心，收集上清液；

(4)取步骤(3)所得上清液，用聚丙烯晴材质的中空纤维膜浓缩，用磷酸盐缓冲液透析，得浓缩酶液；

(5)在步骤(4)所得浓缩酶液中加入固定化载体，室温下搅拌至酶与载体充分结合，抽滤，收集固体，即得头孢菌素C酰化酶固定化酶。

本发明所述步骤(1)中：

所述大肠杆菌发酵液是以甘油为主要碳源、将大肠杆菌生物发酵48h获得；本发明使用的大肠杆菌发酵液中固含量为11～12％(m/m)，OD₆₀₀值为105～120；

步骤1)所述大肠杆菌发酵液中，头孢菌素C酰化酶的酶活为9000～10300U/L；

步骤1)使用陶瓷膜浓缩菌液优势明显，该方法处理量大，处理时间短，后续菌液不需要匀浆即可直接破碎，适合工业化大规模生产；在用陶瓷膜浓缩菌液时，可选用容积泵作为进料泵，从而避免对菌液的破坏，同时可以加快处理速度；所述陶瓷膜优选为50nm陶瓷膜，陶瓷膜的通透量依据待浓缩菌液的体积进行相应的选择，平均通透量优选为69～95LMH；所述浓缩应浓缩到破碎要求的菌液浓度，为了便于实际操作和监控，可浓缩至原体积的1/4～1/5；

使用磷酸盐缓冲液进行透析，可以有效地置换出发酵培养基和代谢产物，以降低其对酶活的影响，提高产品质量；透析用磷酸盐缓冲液的浓度优选为0.01M，pH值优选为7.0，体积优选为待透析溶液体积的2倍，透析终点为与加入磷酸盐缓冲液之前的待透析溶液体积相等；

所述高压破碎优选使用高压均质机，压强为850～900Mpa；破碎次数为1次以上，优选为2～4次，进一步优选为3次，多次破碎可以提高细胞的破碎率与破碎程度，有助于后续的絮凝和过滤；破碎温度应低于35℃，低的破碎温度可以防止酶失活。

本发明所述步骤(2)中：