[发明专利]一种RP-IP-HPLC法收集依诺肝素寡糖的方法

权利要求书

1.一种收集依诺肝素寡糖的方法，包括以下步骤：

a、从依诺肝素中收集出总四糖组分：取浓度为50～70mg/ml的依诺肝素钠溶液用高分辨的凝胶渗透色谱法分离，得到总四糖组分；

b、采用RP-IP-HPLC从总四糖组分中收集出单四糖组分：取总四糖组分配制成浓度为10mg/ml水溶液用反向离子对液相色谱进行预分离，取预分离的四糖子组份分别制成1mg/ml的水溶液再用反向离子对液相色谱进行分离提纯；

c、将所收集的单四糖组分配制成1mg/ml水溶液通过ESI-MS进行结构解析。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中，所述色谱条件如下：

柱系统：两根玻璃柱串联，填料Biogel P10，

流动相：流动相A，流动相A的配制：称取14.71g氯化铵，加入约800ml超纯水溶解后，转移至1000ml容量瓶中，用超纯水定容，摇匀，得到0.25M NH₄Cl溶液，

流速：2.0ml/min，

洗脱类型：等度洗脱，

进样体积：10ml，

收集模式：按峰收集，

起始收集斜率：10mAU/min，

结束收集斜率：2mAU/min，

最小峰收集时间：20min，

检测器：UV 210nm，

运行时间：900min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中，预分离过程中，所述色谱条件如下：

HPLC系统：HPLC，岛津LC-6AD，

柱子：C-18，250x16mm，

流动相：流动相B、流动相C、流动相D、流动相E进行梯度洗脱，

流速：5ml/min，

进样体积：100μl，

收集模式：按时间收集，

收集组分：组分1：14.0-25.5min；组分2：25.5-31.5min；组分3：31.5-37.6min；组分4：37.6-48.8min，

检测器：UV 210/232nm，

运行时间：70min，

流动相B的配制：取溶液A 60ml于100ml容量瓶中，加入40ml甲醇，混匀，

流动相C的配制：取溶液A 57ml于100ml容量瓶中，加入43ml甲醇，混匀，

流动相D的配制：取溶液A 50ml于100ml容量瓶中，加入50ml甲醇，混匀，

流动相E的配制：取溶液A 20ml于100ml容量瓶中，加入80ml甲醇，混匀。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱过程如下：

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中，第2次分离过程中，所述色谱条件如下：

HPLC系统：HPLC-UV岛津LC-6AD，

组分收集器：岛津FRC-10A，

收集模式：按峰收集，

柱子：C18，250x4.6mm，

流动相：流动相F、流动相G进行梯度洗脱，

流速：0.8ml/min，

进样体积：35-50μl，

UV检测器：232nm，

流动相F的配制：取溶液B 90ml于100ml容量瓶中，加入10ml甲醇，混匀，

流动相G的配制：称取乙酸0.674g，加入约800m甲醇溶解后，转移至1000ml容量瓶中，用甲醇定容，摇匀。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱过程如下：

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c中，所述ESI-MS法，所用质谱仪为Waters Xevo G2-S QTOF。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c中，所述ESI-MS法，操作条件如下：