[发明专利]一种非诺特罗的胶体金检测卡及其制备方法有效
申请号: | 201410844525.3 | 申请日: | 2014-12-30 |
公开(公告)号: | CN104569408A | 公开(公告)日: | 2015-04-29 |
发明(设计)人: | 徐波;熊勇华;刘春梅;李林;杨晓慧 | 申请(专利权)人: | 无锡中德伯尔生物技术有限公司 |
主分类号: | G01N33/577 | 分类号: | G01N33/577;G01N33/558 |
代理公司: | 北京品源专利代理有限公司 11332 | 代理人: | 巩克栋;杨晞 |
地址: | 214174 江苏省无锡市惠山区惠*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 非诺特罗 胶体 检测 及其 制备 方法 | ||
技术领域
本发明涉及食品安全检测领域,尤其涉及一种非诺特罗的胶体金检测卡及其制备方法。
背景技术
非诺特罗,属于选择性β2型受体激动剂,它可用于治疗支气管哮喘,尤其对儿童支气管哮喘有较好的疗效。β2型受体激动剂种类较多,其它有盐酸克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、西布特罗、马布特罗、溴布特罗、妥布特罗、氯丙那林、班布特罗等。在畜牧养殖中,有少部分人将盐酸克仑特罗等β2型受体激动剂作为一种生长促进剂非法添加到饲料中,用以改善胴体的品质,但同时也造成食品中β2型受体激动剂的残留。当人们食用残留量大的食品后可能会出现一系列的中毒症状。我国已明令禁止在畜牧业中使用盐酸克仑特罗,沙丁胺醇等β2型受体激动剂。
免疫层析技术是出现于80年代初期,通常以条状纤维层析材料为固相,通过毛细作用使样品在层析条上爬动,层析材料上的受体(如抗体或抗原)与样品中的待测物发生特异性免疫反应而显色。免疫层析技术常见的示踪粒子有胶体金、乳胶、胶体硒、明胶等,其中运用最成功的标记物为胶体金。用胶体金作为特殊标记物的研究始于60年代初,1962年Feldberr等报道了用胶体金标记细胞进行电子显微镜的研究。1971年,Taylor等将胶体金引入电镜免疫标记技术中。90年代以来,由于早孕试纸条的快速推广和使用,使得胶体金检测卡成为开发最多,使用最广,最为成熟的体外诊断试剂。
目前,用于检测非诺特罗公开报道的方法和标准较多:如农业部标准《动物源性食品中β-受体激动剂残留检测液相色谱-串联质谱法》(1025号公告-18-2008),非诺特罗检测限可达0.25μg/kg;辽宁省地方标准《牛羊组织中β-受体激动剂残留检测超高效液相色谱-串联质谱法》(DB 21/3004—2013),非诺特罗检测限可达0.25μg/kg;吉林省地方标准《动物源性食品中24种受体激动剂残留量的测定液相色谱-串联质谱法》(DBS22 012-2013),非诺特罗检测限可达0.1μg/kg;然而用于检测非诺特罗的产品鲜有报道,中国专利文献公开号CN102359961A的专利,公开了一种用于β-肾上腺素受体激动剂类化合物检测的试剂盒,该方法是通过比较样品溶液与空白溶液的变色时间来定性检测非诺特罗,其存在灵敏度低,准确性差,不能定性检测非诺特罗等问题。
发明内容
本发明的目的在于针对上述问题,提供一种非诺特罗的胶体金检测卡及其制备方法,其具有成本低、灵敏度高、检测方便、快捷的特点。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现:
一种非诺特罗的胶体金检测卡,包括卡壳及设置于卡壳内的试纸条,所述试纸条上沿液体流动方向依次设置有样本垫、金标结合物垫、硝酸纤维素膜、吸水垫,所述金标结合物垫上包被有抗非诺特罗单克隆抗体-胶体金结合物,所述抗非诺特罗单克隆抗体-胶体金结合物中的抗非诺特罗单克隆抗体是以非诺特罗偶联抗原Ⅰ为免疫抗原制备的,所述硝酸纤维素膜上邻近金标结合物垫的一端设置有检测线,且硝酸纤维素膜上邻近吸水垫的一端设置有质控线,所述检测线上包被有非诺特罗偶联抗原Ⅱ,所述质控线上包被有抗鼠二抗。
作为本发明的优选方案,所述卡壳由底卡及面卡构成,且卡壳由塑料材料制成。
作为本发明的优选方案,所述面卡上开有加样孔,所述加样孔位于样本垫的上方。
作为本发明的优选方案,所述面卡上开有观察窗,所述观察窗位于硝酸纤维素膜的上方。
一种非诺特罗的胶体金检测卡制备方法,包括以下步骤:
一、金标结合物垫的制备:
a、合成非诺特罗偶联抗原Ⅰ:取载体蛋白,用双蒸水溶解后,再用NaOH调pH至10,加入1,4-丁二醇二缩水甘油醚,在氮气保护下,避光搅拌24小时,通过柱层析纯化制得接臂载体蛋白,所述1,4-丁二醇二缩水甘油醚与蛋白载体的摩尔比为100:1,将非诺特罗调成碱性后,在搅拌条件下缓慢加入到接臂载体蛋白中,氮气保护下室温避光搅拌24小时,反应产物在4℃用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液透析3天,透析后得到非诺特罗偶联抗原Ⅰ;
b、免疫动物:将上述步骤a中制成的非诺特罗偶联抗原Ⅰ与等量弗氏完全佐剂乳化完全后,免疫小鼠;
c、细胞融合和杂交瘤细胞筛选:取经非诺特罗偶联抗原Ⅰ免疫的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,并采用HAT培养基进行培养,对培养上清进行检测,筛选获得稳定分泌抗非诺特罗单克隆抗体的细胞株14F8-B3-C9;
d、制备腹水:将分泌抗非诺特罗单克隆抗体的细胞株14F8-B3-C9培养后,注射入BALB/C小鼠腹腔,收集其腹水;
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