[发明专利]柱状黄杆菌选择性培养基及利用其分离纯化柱状黄杆菌的方法

权利要求书

1.柱状黄杆菌选择性培养基，其特征在于：它是在柱状黄杆菌常规培养基灭菌冷却后加入托普霉素使其终浓度为2 μg/mL、多粘菌素B使其终浓度为20 U/mL，倒平板而得到的柱状黄杆菌选择性固体培养基；

或为在柱状黄杆菌常规培养基的配方中去除琼脂，灭菌冷却后加入托普霉素使其终浓度为2 μg/mL、多粘菌素B使其终浓度为20 U/mL而得到的柱状黄杆菌选择性液体培养基。

2.根据权利要求1所述的柱状黄杆菌选择性培养基，其特征在于：所述的柱状黄杆菌常规培养基为常规Shieh固体培养基。

3.根据权利要求1所述的柱状黄杆菌选择性培养基，其特征在于：所述的常规Shieh固体培养基为：称取蛋白胨5 g、酵母提取物0.5 g、Noble琼脂10 g 、K₂HPO₄ 0.1 g、KH₂PO₄ 0.05 g、乙酸钠0.01 g、NaHCO₃ 0.05 g、MgSO₄·7H₂O 0.3 g、BaCl₂·H₂O 0.01 g、FeSO₄·7H₂O 0.001 g、CaCl₂·2H₂O 0.0067 g加入到1000 mL蒸馏水中，调pH至7.2，灭菌而得。

4.根据权利要求1所述的柱状黄杆菌选择性培养基，其特征在于：所述的灭菌温度120℃，灭菌时间为20min。

5.根据权利要求3所述的柱状黄杆菌选择性培养基，其特征在于：所述的灭菌温度120℃，灭菌时间为20min。

6.利用权利要求1所述的柱状黄杆菌选择性培养基分离纯化柱状黄杆菌的方法，其特征在于：步骤如下：

1）、在鱼类病灶上，采用无菌操作，将细菌通过划平板法接种到柱状黄杆菌常规固体培养基上进行培养，至培养基上观察到柱状黄杆菌的典型黄色菌落；

2）、挑选上述步骤培养得到的单一黄色菌落，划线接种到柱状黄杆菌选择性固体培养基上，进行培养

3）、挑选上述步骤培养得到的单一黄色菌落，再次接种到柱状黄杆菌选择性液体培养基上，进行培养；

4）将上述步骤培养得到的黄色菌液按照10倍系列稀释，均匀涂布到状黄杆菌选择性固体培养基上，进行培养；

5）挑选最低稀释倍数出现细菌的平板上的单一黄色菌落，接种到柱状黄杆菌选择性液体培养基上，进行培养，然后经确证为纯的柱状黄杆菌菌种后，进行低温保存或干燥保存，即得分离纯化后的柱状黄杆菌。

7.根据权利要求6所述的分离纯化柱状黄杆菌的方法，其特征在于：所述的培养为26-28℃培养24-26小时。

8.根据权利要求6所述的分离纯化柱状黄杆菌的方法，其特征在于：所述步骤4）中进行10倍系列稀释后得到稀释度为10^-5~10^-8的体系。

9.根据权利要求6所述的分离纯化柱状黄杆菌的方法，其特征在于：在进行一次选择分离后未能得到纯的柱状黄杆菌后，再重复步骤2）到步骤5），直到获得纯的柱状黄杆菌菌种。

10.根据权利要求6所述的分离纯化柱状黄杆菌的方法，其特征在于：所述柱状黄杆菌的确证包括进行形态学实验，生理生化实验和细菌16S rDNA基因测序实验，基于形态学特征，生理生化特征和16S rDNA基因序列特征进行确证。