[发明专利]一种生产禽脑脊髓炎病毒灭活疫苗的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用细胞系生产禽脑脊髓炎病毒灭活疫苗的方法，属生物技术领域。 

背景技术

禽脑脊髓炎(Avian Encephalomyelitis; AE)又称流行性震颤，是由禽脑脊髓炎病毒(AEV)引起的一种主要危害 4 周龄以下雏鸡，以侵害雏鸡中枢神经系统，引起雏鸡非化脓性脑炎为主要病理特征的病毒性传染病，病雏主要表现为运动失调、头颈震颤和后趾麻痹等神经症状。具有突然出现和难以预测持续期等特点，能造成雏鸡的损失和母鸡产蛋率的下降，成为当前世界上危害养禽业发展的主要疫病之一。我国自80 年代中期有此病发生的报道以来，在全国各地均有发生和流行, 给养鸡业造成了较大的损失。目前该病尚无有效的治疗药物，因此预防免疫显得更为重要。

禽脑脊髓炎病毒(AEV)属于小RNA病毒科，肝病毒属，能在易感鸡群的雏鸡、鸡胚中高效价繁殖。国内外已有应用原代鸡胚源细胞（鸡胚成纤维、肾细胞、神经胶质细胞、胰细胞等）培养禽脑脊髓炎病毒的研究报道，但病毒效价低，均不超过10^3.5EID₅₀/ml。还未有成功应用细胞系培养禽脑脊髓炎病毒的报道，目前禽脑脊髓炎病毒疫苗制备均采用鸡胚法。用鸡胚培养禽脑脊髓炎病毒，需要用大量SPF鸡胚，生产成本高、劳动强度大、产品批间差异大，给疫苗产量、质量的提高带来困难。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术之缺陷提供一种利用细胞系生产禽脑脊髓病毒灭活疫苗的方法。

本发明所述技术问题是由以下技术方案解决的。

一种生产禽脑脊髓炎病毒灭活疫苗的方法，包括如下步骤：

a. 选择细胞系作为制苗用细胞；

b. 制苗用细胞的传代与培养

制苗用细胞形成良好单层时，经EDTA-胰酶消化后，加入细胞生长液制备成细胞悬液，用于继续传代或接种病毒；

c. 生产用毒种的繁殖

将制苗用细胞悬液，分装细胞培养瓶，同时接种禽脑脊髓炎鸡胚组织毒，培养72h时更换细胞维持液，继续培养48～72h，收获培养物，为一代细胞毒；一代细胞毒传代培养，为二代细胞毒；取一代、二代细胞毒作为生产用毒种；

d. 生产制苗毒液

将制苗用细胞悬液，分装细胞培养瓶，同时接入禽脑脊髓炎病毒生产用毒种进行培养，72h时更换细胞维持液，继续培养48～72h，收获培养物，-15℃保存。

e.疫苗制备

将收获的制苗毒液灭活后加入佐剂，乳化制备成禽脑脊髓炎病毒灭活疫苗。

上述生产禽脑脊髓炎病毒灭活疫苗的方法，所述步骤a中细胞系是幼仓鼠肾传代细胞（BHK21）、鸡胚成纤维细胞系（DF-1）。幼仓鼠肾传代细胞（BHK21）经过有限稀释法克隆纯化筛选。

上述生产禽脑脊髓炎病毒灭活疫苗的方法，所述步骤c和d中，禽脑脊髓炎鸡胚组织毒的接种量为细胞生长液的0.5%～2%（V/V），细胞毒接种量为细胞生长液的1%～3%（V/V）。

上述生产禽脑脊髓炎病毒灭活疫苗的方法，所述步骤c和d中，在幼仓鼠肾传代细胞（BHK21）接种病毒后，37℃培养24h，转为33℃再培养96h～120h。

上述生产禽脑脊髓炎病毒灭活疫苗的方法，所述步骤c和d中，在鸡胚成纤维细胞系（DF-1）接种病毒后，37℃培养120 h～144 h。

上述生产禽脑脊髓炎病毒灭活疫苗的方法，所述步骤b中，细胞生长液的配方是：体积百分含量90～92%低糖DMEM 或DMEM/F12液、8～10%新生牛血清、适量的抗生素，pH值调整为7.0-7.4。

上述生产禽脑脊髓炎病毒灭活疫苗的方法，所述步骤c和d中，细胞维持液的配方是：体积百分含量97～99%低糖DMEM 或DMEM/F12液、1～3%新生牛血清、适量的抗生素，pH值调整为7.2-7.4。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.在本发明中，用细胞系替代鸡胚培养禽脑脊髓炎病毒，病毒适应性好、效价高；

2.在本发明中，幼仓鼠肾传代细胞（BHK21）经过纯化筛选，提高了细胞对病毒的敏感性，保证了细胞的状态均一，减小批次间差异，确保生产工艺参数和产品质量的稳定；

3.本发明中，病毒接种时采用同步接种法，无需吸附，简化操作，节省人力；

4.本发明中，在幼仓鼠肾传代细胞（BHK21）接种病毒24h后，降低培养温度，减慢了细胞老化速度，提升了细胞活力，提高了病毒效价；